فحص أكسدة الركيزة في الخلايا المستنبتة: اختبار في المختبر لتحديد أكسدة الركيزة في الخلايا عن طريق قياس الإشارات المشعة من ثاني أكسيد الكربونالمحاصر 2

الملخص

المصدر: Song، C. et al. ، تقييم أكسدة ركيزة الطاقة في المختبر مع ¹⁴ثاني أكسيد الكربون₂ trapping. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية القياس الكمي لثاني أكسيد الكربون₂ المنبعث أثناء أكسدة الركيزة باستخدام ¹⁴ركيزة ذات علامات إشعاعية C. يتم احتجاز ¹⁴ثاني أكسيد الكربون_الذي تم إطلاقه في محلول قلوي ويتم قياسه كميا بواسطة عداد التلألؤ. تختلف أكسدة الركائز المختلفة بين الأنسجة وتعكس الحالة الفيزيولوجية المرضية للأنسجة.

البروتوكول

يتطلب استخدام المواد المشعة (RAM) موافقة مسبقة من لجنة السلامة المعينة في كل مؤسسة.

فئة

1. تحضير حلول المخزون ل ¹⁴ركيزة تحمل علامة C

1. اصنع محلول مخزون مصل الألبومين البقري (BSA) بسعة 4 ملي مولار عن طريق خلط 11 جم من BSA و 33.1 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) ورجها برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 3 ساعات حتى يذوب BSA تماما. قم بتسخين محلول مخزون BSA في حمام مائي 70 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. تجفيف الهواء 50 μCi ¹⁴C-oleate (50 μCi / μmol في الإيثانول) في القارورة مع الغطاء لمدة 8 ساعات في شفاط عمل مخصص لذاكرة الوصول العشوائي. أضف 312.5 ميكرولتر من H₂O ثم 3.5 مجم (11.5 ميكرومول) من أوليات الصوديوم. تخلط جيدا.
3. قم بتسخين المحلول الناتج إلى 70 درجة مئوية في حمام مائي. أضف 0.9375 مل من محلول مخزون BSA الدافئ مسبقا لإنتاج محلول مخزون أوليات ساخن 10 ملي مولار (يحتوي على نسبة 1: 11.5 من ¹⁴C-oleate إلى أوليات غير مصنف). قم بتخزين محلول المخزون وتخزينه عند -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد.
4. استخدم ¹⁴C-glucose و ¹⁴C-glutamine مباشرة بعد الذوبان.

< p class = "jove_title" >2. تحضير وسط يحتوي على ¹⁴ركيزة تحمل علامة C

ملاحظة: لضمان تركيزات موثوقة لركائز الطاقة في الوسائط ، يجب استخدام الوسائط المصنوعة حسب الطلب مع ركائز جديدة تضاف قبل الاستخدام بوقت قصير. هنا ، يتم استخدام الحد الأدنى من الوسط الأساسي المخصص (MEMα) بدون الجلوكوز أو البيروفات أو الجلوتامين أو الفينول الأحمر أو بيكربونات الصوديوم. ومع ذلك ، يجب تحديد الوسيط الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا.

1. أعد تكوين 8.67 جم من المسحوق المتوسط في 1 لتر من الماء النقي. أضف 2.2 جم من بيكربونات الصوديوم لتحقيق درجة حموضة 7.4 وقم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 ميكرومتر من الترشيح الفراغي.
2. أضف مكونات طازجة للحصول على الوسط الكامل (cMEMα) بتركيزات نهائية تبلغ 5.5 ملي مولار من الجلوكوز ، و 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 1 ملي مولار من البيروفات ، و 10٪ مصل بقري الجنين (FBS). مزيد من المكملات cMEMα مع 100 ملي مولار L-carnitine و 10 ميكرومتر HEPES لتسهيل أكسدة الأحماض الدهنية.
3. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف ¹⁴ركيزة تحمل علامة C إلى cMEMα المحضرة حديثا لعمل وسائط ساخنة. لجعل وسط الأوليات ساخنا ، أضف محلول مخزون الأوليات الساخن 10 ملي مولار إلى cMEMα للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر من الأوليات (تخفيف 1: 100 ، النشاط الإشعاعي النهائي 0.4 ميكرومتر / مل).
   ملاحظه: يستخدم مخزون الأوليات الساخن 10 ملي مولار الذي يحتوي على نسبة 1: 11.5 من الأوليات الساخنة: الباردة (انظر الخطوة 1.3) لتحقيق مستوى فسيولوجي يبلغ 100 ميكرومتر إجمالي أوليات في الوسائط مع تقليل كمية المواد المشعة.
4. اصنع 10 ملي من مرق الأوليات غير المسمى عن طريق إضافة 24.36 مجم من أوليات الصوديوم إلى 2 مل من H₂O في حمام مائي عند 70 درجة مئوية لمدة ~ 20 دقيقة حتى يذوب تماما قبل الخلط بسرعة مع 6 مل من محلول مخزون BSA 4 ملي مسخن مسبقا إلى 70 درجة مئوية. انقله إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد.
5. لجعل الجلوكوز وسط ساخن ، أضف ¹⁴C-glucose إلى التركيز النهائي البالغ 1.333 ميكرومتر (تخفيف 1: 4،125 ، النشاط الإشعاعي النهائي 0.4 ميكروCi / مل). لجعل وسط الجلوتامين ساخنا ، أضف ¹⁴C-glutamine إلى التركيز النهائي البالغ 2 ميكرومتر (تخفيف 1: 1,000 ، النشاط الإشعاعي النهائي 0.4 ميكروCi / مل).
6. استكمل وسط الجلوكوز والجلوتامين الساخن بمحلول مخزون 10 ملي مولار من الأوليات غير المسمى من الخطوة 2.4 لتحقيق التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومتر من الأولات ، وهو نفس التركيز الموجود في وسط أوليات الساخن.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الخلايا

ملاحظة: تستخدم بانيات العظم الجلجلية والضامة لنخاع العظم كأمثلة هنا. يجب على المستخدمين إعداد نوع الخلية التي يختارونها وفقا للبروتوكولات المناسبة. قم بتحسين تركيز الكولاجيناز II لاستخدامه في الهضم في التجارب التجريبية حيث قد يختلف النشاط الأنزيمي بين المجموعات المختلفة.

1. عزل واستزراع بانيات العظم الجلدية
   1. التضحية بالجراء بعد الولادة 3-5 (P3-5) عن طريق قطع الرأس ونقلها إلى DPBS المثلج الذي يحتوي على البنسلين والستربتومايسين (P / S).
   2. كشف الجلسنة عن طريق إزالة الجلد والأنسجة الرخوة. اجمع المنطقة الوسطى عن طريق قطع الأنسجة المحيطة من الخلف إلى الأمام في DPBS (الشكل 1 أ). خدش الأسطح الداخلية والخارجية للكالفاريا برفق باستخدام ملاقط للمساعدة في إطلاق الخلايا عند الهضم اللاحق.
   3. قم بإعداد محلول 2 مجم / مل و 4 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الثاني في DPBS وقم بتصفية كل محلول بمرشح جديد 0.22 ميكرومتر. هضم الكالفاريا النظيفة أولا بمحلول الكولاجيناز 2 مجم / مل لمدة 15 دقيقة وتخلص من محلول الهضم. هضم العينات التي تم تنظيفها في محلول كولاجيناز 4 مجم / مل 3 مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة ، مع تجميع محلول الهضم وحفظه.
   4. قم بتصفية محلول الهضم من خلال مصافي خلية 70 ميكرومتر وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
   5. عد الخلايا وبذرها في 4 × 10⁴ خلايا / سم² في ألواح 10 سم. زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 أيام.
   6. فصل الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 0.25٪ تريبسين-EDTA. عد الخلايا وبذرها في ألواح زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا مع cMEMα التي تحتوي على 10٪ FBS و P / S عند 7.5 × 10⁵ / سم². قم بزرع ما لا يقل عن 4 آبار لكل نوع خلية لكل ركيزة وثلاثة آبار إضافية على الأقل لكل نوع خلية لعد الخلايا قبل الفحص.
   7. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل فحوصات أكسدة الركيزة.
2. عزل وثقافة BMMs
   ملاحظة: تتطلب زراعة BMMs عاملا محفزا لمستعمرة البلاعم (M-CSF) ، والذي يمكن شراؤه تجاريا كبروتين مؤتلف. يعد الوسط المكيف من خط الخلية CMG14-12 المصمم للتعبير عن M-CSF بديلا اقتصاديا يستخدم هنا.
   1. اجمع عظم الفخذ والظنبوب من الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع بعد إزالة العضلات والأنسجة الضامة. قص وتجاهل طرفي العظام بمقص حاد.
   2. اغسل نخاع العظم من عظم الفخذ والساق في طبق بتري مقاس 10 سم باستخدام حقنة مزودة بإبرة 23 جم تحتوي على 15 مل من cMEMα مع 10٪ FBS و P / S و 10٪ CMG14-12 وسط مكيف (متوسط BMM). استزراع الخلايا في طبق بتري في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   3. بعد 3 أيام ، تخلص من وسائط المزرعة واشطفها باستخدام DPBS. قم بفصل الخلايا المرفقة عند 37 درجة مئوية مع 0.25٪ تربسين-EDTA لمدة 5 دقائق. جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط BMM.
   4. عد الخلايا وبذرها في ألواح زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا عند 7.5 × 10⁵ / سم² بنفس الطريقة الموضحة في 3.1.6. استزراع عند 37 درجة مئوية طوال الليل في وسط BMM قبل بدء المقايس.

فئة

4. مقايسة أكسدة الركيزة مع مصيدة ثاني أكسيد الكربون₂

ملاحظة: يجب تحديد كثافة بذر مناسبة لكل نوع من أنواع الخلايا لتحقيق التقاء 80-90٪ قبل بدء الفحص. لاحظ أن كثافة الخلايا يمكن أن تؤثر على حالة التمثيل الغذائي للخلايا.

1. اغسل الخلايا في الآبار الإضافية مرتين باستخدام DPBS. قم بفصل الخلايا مع 0.25٪ تريبسين-EDTA وخلط 20 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في DPBS مع 20 ميكرولتر من محلول الصبغة التجاري الجاهز للاستخدام من برتقال أكريدين / يوديد البروبيديوم (AO / PI). حدد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الآلي وسجل الرقم للحسابات النهائية.
2. اغسل الخلايا في آبار الفحص مرتين باستخدام DPBS. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الساخن إلى كل بئر فحص في غطاء زراعة الأنسجة المخصص لذاكرة الوصول العشوائي. أغلق الألواح بالبارافيلم واحتضان الخلايا في حاضنة مخصصة لذاكرة الوصول العشوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
3. أثناء الحضانة ، قم بتقطيع ورق الترشيح إلى قطع دائرية أكبر قليلا من المساحة الموجودة داخل غطاء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وأدخل الورق بإحكام في الغطاء (الشكل 1 ب). أضف 200 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 1 M إلى كل أنبوب و 20 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم إلى ورق الترشيح المثبت داخل الغطاء.
4. بعد حضانة الخلايا ، انقل 400 ميكرولتر من وسط الثقافة من كل بئر إلى الأنابيب المحضرة وأغلق الأغطية على الفور. اترك الأنابيب في رف أنبوبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
5. أثناء الحضانة ، قم بإعداد قارورة تلألؤ لكل أنبوب واملأها ب 4 مل من سائل التلألؤ. انقل كل قطعة من ورق الترشيح إلى قارورة متلألئة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
6. قم بإجراء اختبارات المسح على غطاء زراعة الأنسجة ، والحمام المائي (المستخدم لتحضير ¹⁴C-oleate) ، والثلاجة ، والحاضنة ، والحوض ، والأرض ، وأي منطقة عمل أخرى لتلوث ذاكرة الوصول العشوائي المحتمل. ضع المناديل الورقية في قوارير متلألئة تحتوي على سائل تلألؤ.
7. قم بقياس النشاط الإشعاعي ¹⁴درجة مئوية في قوارير التلألؤ باستخدام عداد التلألؤ. سجل نتائج القراءة. تطهير بيئة العمل وفقا لإرشادات السلامة الإشعاعية إذا لزم الأمر.

النتائج

الشكل 1: مخططات لمقايسة محاصرة ثاني أكسيد الكربون₂ وتشريح كالفاريا. (أ) يتم حصاد المنطقة الوسطى من كالفاريا ، المشار إليها بالمثلث البرتقالي المتقطع ، لعزل الخلايا. (ب) تستخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لاحتجاز ثاني أكسيد الكربون₍الخطوة 1). يتم قص أوراق الترشيح (الورق الأزرق لأغراض التوضيح) لتلائم أغطية الأنبوب (الخطوة 2). أضف 200 م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشحات 0.22 ميكرومتر سيجما ألدريتش SLGVM33RS تستخدم لتصفية حل BSA 0.25٪ تريبسين EDTA جيبكو 25200056 فصل الخلايا عن زراعة الخلايا
لوحات 1.5 مل أنابيب Eppendorf PR1MA العلاقات العامة MCT17 RB تستخدم لحضانة التفاعل أطباق 10 سم برنامج النقاط التجارية 93100 تستخدم لزراعة الخلايا حقنة 10 مل دينار بحريني 302995 تستخدم لطرد النخاع من
عظام 10٪ FBS أتلانتا البيولوجية S11550 لتحضير وسط زراعة الخلايا 14 ج - الجلوكوز بيركين إلمر NEC042X050UC تستخدم لصنع الوسائط الساخنة 14 سي جلوتامين بيركين إلمر NEC451050UC تستخدم لصنع الوسائط الساخنة 14 سي أوليات بيركين إلمر NEC317050UC تستخدم لصنع الوسائط الساخنة 23 جرام إبرة دينار بحريني 305120 تستخدم لطرد النخاع من
عظام أطباق 24 بئر برنامج النقاط التجارية 92024 تستخدم لزراعة الخلايا مصافي الخلايا 70 ميكرومتر ميدسي 70 خلية تستخدم لتصفية المادة الطافية أثناء
الهضم الجافي أكريدين برتقال / بروبيديوم يوديد
صبغة (AO / PI) نكسيل العلوم البيولوجية عال2-0106 يلطخ الخلايا الحية لتحديد البذور
كثافة مصل الأبقار أبولومين Proliant البيولوجية 68700 تستخدم لاقتران الأحماض الدهنية عداد السيلومتر التلقائي 2000 نكسيل العلوم البيولوجية تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة الطرد المركزي ثيرمو فيشر ليجند مايكرو 21R تستخدم لخلايا الحبيبات الكولاجيناز النوع الثاني ورثينجتون LS004176 فصل الخلايا عن الأنسجة مخصص MEM ألفا جيبكو رمز المنتج: ME 18459P1 تستخدم لإنشاء وسائط ساخنة مخصصة Dulbecco's Fossil-Buffered
ملح جيبكو 10010023 تستخدم لإذابة وتخفيف الكواشف ،
وغسل أطباق الثقافة ورق الترشيح ميليبور سيجما WHA1001090 مصائد ثاني أكسيد الكربون 2 بهيدروكسيد الصوديوم الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 7528 تستخدم لعمل وسائط مخصصة هيبس جيبكو 15630080 يصبس ثاني أكسيد الكربون 2 أثناء زراعة الخلايا ل كارنيتين سيجما ألدريتش سي 0283 مكمل لأكسدة الأحماض الدهنية ل-جلوتامين سيجما ألدريتش جي 3126 تستخدم لعمل وسائط مخصصة MEM ألفا الحراريه أ 10490 وسط زراعة الخلية بارافيلم تغليف بلاستيكي Pecheney PM998 تستخدم لإغلاق أطباق زراعة الخلايا البنسلين - ستربتومايسين ثيرمو فيشر 15140122 يمنع التلوث في زراعة الخلايا حمض البركلوريك سيجما ألدريتش 244252 يطلق ثاني أكسيد الكربون 2 أثناء التمثيل الغذائي
تحليل بيروفات سيجما ألدريتش ص 5280 تستخدم لعمل وسائط مخصصة عداد التلألؤ بيكمان كولتر إل إس 6500 يحدد النشاط الإشعاعي من
ورق الترشيح سائل التلألؤ MP الطب الحيوي 882453 امتصاص الطاقة المنبعثة من ذاكرة الوصول العشوائي
وإعادة انبعاثه كومضات من الضوء قارورة التلألؤ فيشر ساينتيك 03-337-1 حاويات التفاعل للتألق
مائع صودا سيجما ألدريتش الطراز S5761 المخزن المؤقت للميزان للمتوسط هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش 58045 يحبس ثاني أكسيد الكربون2 أثناء فحص metaboilc أوليات الصوديوم سانتا كروز الرقم SC-215879 الأحماض الدهنية المترافقة BSA
اعداد ترشيح الفراغ 1000 برنامج النقاط التجارية 99950 تصفية cMEMα