$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE
فئة
1. تحضير LED لإضاءة الضوء الأزرق
- قم بتشغيل لوحة LED باستخدام التطبيق المرتبط المثبت على جهاز لوحي / هاتف. ضع مسبار مقياس الطيف في بئر فارغ من طبق مكون من 6 آبار واضبط ضوء LED على الطول الموجي الذي يبلغ ذروته عند ~ 456 نانومتر من خلال التطبيق. ضع المستشعر البصري لمقياس الطاقة الضوئية في البئر الفارغ واضبط قوة ضوء LED (~ 0.61 ميجاواط / سم2). يمكن حفظ إعداد ضوء LED ويمكن استرداده في التطبيق.
- أدخل إعداد الطبق/لوحة LED إلى الحاضنة عند 28 درجة مئوية. قم بإنهاء هذه الخطوة قبل أن يبدأ تصوير الأسماك بقوة 48 حصانا في الفرنكال.
< p class = "jove_title" >2. تصوير يرقات الزرد التي تعبر عن TDP-43 البصري
- حدد Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة قبل 47 hpf على الأقل ، بناء على RFP (opTDP-43h) أو EGFP (EGFP-TDP-43z) مضان في العمود الحركي الشوكي باستخدام مجهر epifluorescence المجهز بعدسة موضوعية Plan-Neofluar 5x / 0.15.
- Dechorionate Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة.
- يسخن 1٪ درجة حرارة انصهار منخفضة ، يحتوي على 250 ميكروغرام / مل من ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات عند 42 درجة مئوية.
- تخدير Tg لفترة وجيزة [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43] الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة عند 48 hpf في E3 مخزن مؤقت يحتوي على نفس تركيز Tricane.
- ضع قطرة من درجة حرارة الانصهار المنخفضة المسخنة مسبقا بنسبة 1٪ على طبق القاعدة الزجاجية في درجة حرارة الغرفة. يبلغ قطر قطرة الاغاروز على شكل قبة على الطبق الزجاجي 8-10 مم.
- باستخدام ماصة باستور ، أضيفي السمك المخدر إلى درجة حرارة الانصهار المنخفضة على طبق القاعدة الزجاجية ، ثم اخلطيها عن طريق سحب العينات عدة مرات. قلل من كمية المخزن المؤقت E3 المضافة إلى الاغاروز مع السمكة.
- حافظ على السمكة على جانبها باستخدام إبرة حقنة أثناء تصلب الاغاروز (عادة ~ 1 دقيقة) للتأكد من أن الحبل الشوكي في وضع أفقي مناسب. بعد التصلب ، ضع بضع قطرات من المخزن المؤقت E3 على سمكة الاغاروز المثبتة على شكل قبة.
- الحصول على مقاطع z متسلسلة متحدة البؤر للحبل الشوكي عن طريق المسح الضوئي باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بعدسة موضوعية غمر في الماء 20x مع فتحة عددية 1.00 ، باستخدام سرعة مسح 4.0 ميكرو ثانية لكل بكسل (12 بت لكل بكسل) ، وحجم خطوة 1.0 ميكرومتر لكل شريحة للهدف ، ومزيج من الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث: القناة 1) 473/510 نانومتر ل EGFP والقناة 2) 559/583 نانومتر ل mRFP1.
ملاحظه: يتم تضمين العباءة الموجودة على الجانب البطني من الأسماك في مناطق الاهتمام (ROI) كمرجع ، مما يساعد على تحديد ومقارنة أجزاء العمود الفقري (المستويات 16-17) عبر النقاط الزمنية.
- قم بإزالة السمكة من الاغاروز عن طريق تكسير الاغاروز بعناية بإبرة حقنة بمجرد اكتمال التصوير. حافظ على مقدار الوقت الذي يتم فيه تضمين الأسماك في الاغاروز في أقصر وقت ممكن ، على الرغم من أن تضمين الاغاروز لمدة <30 دقيقة لا يؤثر على بقاء الأسماك.
فئة
3. التحفيز الضوئي للأسماك التي تعبر عن opTDP-43h عن طريق الإضاءة الميدانية لضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء الأزرق (LED)
- أضف 7.5 مل من المخزن المؤقت E3 إلى البئر وضع Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة في البئر. ضع الطبق المكون من ستة آبار على لوحة LED عن طريق إبقاء الطبق ولوحة LED على بعد 5 مم باستخدام فاصل (على سبيل المثال ، مع تكديس خمسة أكواب منزلقة).
- قم بتشغيل ضوء LED الأزرق. احتفظ ببعض الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z] في طبق منفصل من ستة آبار مغطى بورق الألمنيوم عندما تكون أسماك التحكم غير المضاءة ضرورية (أي في الظروف المظلمة).
- بعد الإضاءة (على سبيل المثال ، لمدة 24 ساعة عند 72 حصانا في الشكل 1) ، قم بتصوير الحبل الشوكي للأسماك المضيئة عن طريق تكرار الخطوات 2.3 - 2.9.
