فحص مبيدات النيماتودا الجزيئية الصغيرة: طريقة متوسطة الإنتاجية لفحص مبيدات النيماتودا المحتملة ضد Ditylenchus dipsaci

الملخص

المصدر: Cammalleri، S. R.، et al. زراعة وفحص الديدان الخيطية الطفيلية النباتية Ditylenchus dipsaci. J. Vis. Exp. (2022).

في هذا الفيديو ، نعرض فحص فحص لتحديد فعالية مبيدات النيماتودا ذات الجزيئات الصغيرة ضد الديدان الخيطية. تعتبر مبيدات النيماتودا فعالة إذا تسببت في انخفاض عدد الديدان الخيطية المتنقلة في العينة بعد التعرض.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

< p class = "jove_title" >1. في المختبر شاشة جزيء صغير

1. قم بإعداد لوحات الفحص باتباع الخطوات أدناه.
   1. صب الماء المقطر المعقم في حوض معقم ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من الماء المقطر من الحوض الصغير في كل بئر من صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا.
2. تحضير أداة التثبيت وإضافة المواد الكيميائية.
   1. قم بإعداد صواني دبوس (انظر جدول المواد) بالقرب من لهب موقد بنسن على مقعد المختبر. أضف ما يلي إلى صواني الدبوس المتتالية: 25 مل من محلول تنظيف الدبوس ، و 35 مل من 50٪ DMSO (في الماء) ، و 45 مل من الماء المقطر ، و 55 مل من 70٪ EtOH ، و 65 مل من 95٪ EtOH. ضع قطعة واحدة من ورق النشاف أمام كل درج.
   2. قم بتنظيف أداة التثبيت عن طريق إخراج المسامير في محلول التنظيف وتحريك المسامير لأعلى ولأسفل ثلاث مرات (3x) في المحلول. في هذا البروتوكول ، يتم تعريف "3x" و "10x" على أنهما تحريك المبوس لأعلى ولأسفل في محلول ثلاث أو عشر مرات ، على التوالي. امسح المسامير على ورق النشاف. كرر هذا الإجراء مرة أخرى.
      1. بعد ذلك ، اشطف المسامير 3 مرات في الماء المقطر ، متبوعا بتنظيف المسامير. كرر الإجراء مرة أخرى.
      2. أخيرا ، اشطف المسامير 3 مرات في 95٪ EtOH ، متبوعا بنشاف المسامير. كرر مرة أخرى. أشعل الدبوس واترك الإيثانول يتبخر.
   3. أضف مواد كيميائية من ألواح المخزون الكيميائية المكونة من 96 بئرا إلى لوحات الفحص عن طريق تثبيت 3x في اللوحة الكيميائية ، ثم نقل المسامير 10X إلى لوحة الفحص. امسح على الورق أمام محلول التنظيف.
   4. نظف أداة التثبيت بين الألواح عن طريق الغسيل بالترتيب التالي ، مع النشاف بينهما على ورق النشاف: 3x في 50٪ DMSO (مرة واحدة) ، 3x في الماء المقطر (مرة واحدة) ، 3x في 75٪ EtOH (مرة واحدة) ، 3x في 95٪ EtOH (مرتين). شعلة الدبوس والسماح للإيثانول بالتبخر.
   5. كرر الخطوة 1.2.2 عند اكتمال جميع عمليات التثبيت.
      ملاحظه: تم إجراء الفحص بتركيز نهائي قدره 60 ميكرومتر.
3. إضافة الديدان
   1. احسب عدد الديدان الخيطية من المجموعة عن طريق إعادة تعليق 5 ميكرولتر أولا ثم سحب ماصتها باستخدام أطراف احتجاز منخفضة على شريحة للمراقبة. احسب عدد الديدان الخيطية في 5 ميكرولتر باستخدام مجهر التشريح.
      1. اضبط التركيز على 2 دودة / ميكرولتر باستخدام الماء المقطر المعقم. باستخدام ماصة متعددة القنوات وحوض صغير، أضف 10 ميكرولتر (~ 20 دودة) إلى كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا.
         ملاحظه: سيتم جمع ما يقرب من 15,000 من الديدان الخيطية D. dipsaci لكل صفيحة استزراع باستخدام طريقة الاستزراع والتجميع الموصوفة. يتم استخدام عشرين ديدانا لكل بئر لأن العدد الصغير يسهل التصور والمحاسبة الواضحين للديدان المتنقلة وغير المتنقلة.
   2. أغلق الألواح في غلاف تغليف المختبر ولفها بمنشفة ورقية مبللة. ضعها في الصندوق وألصقها على وسادة لاصقة في حاضنة اهتزاز 20 درجة مئوية مثبتة عند 200 دورة في الدقيقة. تأكد من تثبيت الألواح في الصندوق عن طريق إضافة منشفة ورقية مبللة إضافية لضمان الحد الأدنى من حركة الألواح.

2. جمع البيانات وتحليلها

1. راقب اللوحات في اليوم 5 تحت مجهر تشريح. احسب العدد المتنقل والإجمالي للعدد الإجمالي ل D. dipsaci في ضوابط مذيبات DMSO والآبار المعالجة بالأدوية.
   1. إذا كانت الديدان غير متحركة نسبيا ، أضف 2 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 40 ملي مولار في البئر لتحفيز الحركة.
      ملاحظه: بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم ، ستتحرك الديدان على الفور وتحتاج إلى عرضها في غضون 5 دقائق. سيتم استخدام عدد الديدان المتنقلة والعدد الإجمالي للديدان لحساب نسبة الديدان المتنقلة. قد يتغير طول الفحص حسب هدف الشاشة.
2. احسب نسبة الديدان المتنقلة. في D. dipsaci الشاشات ، يتم تصنيف الآبار التي أنتجت 0٪ من الديدان المتنقلة بشكل متكرر على أنها ضربات قوية.
   ملاحظه: يتم تجنب التعرض المطول للألواح على مرحلة مجاهر التشريح لأن مصدر الضوء يمكن أن يسخن الألواح ويؤدي إلى تأثيرات متغيرة على المقايسة الحيوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات دورق 50 مل بيركس CLS100050 96 لوحة بئر سارستيدت 83.3924 رقائق الألومنيوم ألكان بلس نطاق تشريح لايكا لايكا MZ75 DMSO سيجما ألدريتش 472301-500 مل شريحة زجاجية ماجنا 60-1200 ورق نشاف خال من الوبر فيكتوريا آند بورز العلمية نائب الرئيس 522-100 أطراف ماصة منخفضة الاحتجاز (200 ميكرولتر) لابفورس 1159 م 44 ماصة متعددة القنوات أبحاث Eppendorf بالإضافة إلى 3125000036 هيدروكسيد الصوديوميوم سيجما ألدريتش S8045-500G بارافيلم بيميس PM-996 حلول تنظيف الدبوس فيكتوريا آند بورز العلمية VP110A بينر فيكتوريا آند بورز العلمية VP381N صواني شطف دبوس فيكتوريا آند بورز العلمية VP 421 خزان كاشف مع غطاء للماصات متعددة القنوات سيجما ألدريتش BR703459 حاضنة الاهتزاز نيو برونزويك العلمي أنا26