فحص التمعدن في المختبر: طريقة لقياس الألوان لتحديد رواسب الكالسيوم في الأرودة العظمية على بديل الكسب غير المشروع للعظام عن طريق تلطيخ واستخراج Alizarin Red S

الملخص

المصدر: Kampleitner، C. et al. ملف تعريف التوافق البيولوجي على المواد الحيوية لتجديد العظام. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة للكشف عن رواسب الكالسيوم المفرزة من بانيات العظم باستخدام صبغة أنيونية ، Alizarin Red S. يتم تلطيخ بانيات العظم المستنبتة أولا ثم يتم استرداد الصبغة للقياس الكمي اللوني لرواسب الكالسيوم أو درجة تمعدن بانيات العظم.

البروتوكول

1. مقايسة تمعدن العظم

1. قم باحتضان أقراص فوسفات ثلاثي الكالسيوم β بقطر 14 مم (β-TCP) مسبقا في 1 مل من وسط نمو العظام (BGM) في صفيحة ثقافة معلقة مكونة من 24 بئرا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة قبل إضافة بانيات العظم (OBs). استخدم ألواح زراعة الأنسجة القياسية للتحكم ولوحات ثقافة التعليق لعينات المواد الحيوية لتجنب ارتباط الخلية بالبلاستيك.
2. استنشق وسط ما قبل الحضانة ثم أعد تعليق OBs الأولية للفأر في BGM. أضف 8.8 × 10 درجة OBs / سم² إلى أقراص β-TCP المحتضنة مسبقا في لوحة ثقافة معلقة 24 بئرا ولمجموعة التحكم ، في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا (1 مل / بئر). سوف تعلق OBs على لوحة زراعة الأنسجة أو عينة المواد الحيوية.
3. استبدل BGM ب 1 مل من وسط التمعدن العظمي (MM) الذي يحتوي على BGM ، و 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك ، و 5 ملي مولار β-جليسيروفوسفات بعد 24 ساعة من إضافة OBs واحتضانه لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام باستخدام 1 مل من MM الطازج لكل بئر.

< p class = "jove_title" >2. تم تقييم تمعدن العظم عن طريق تلطيخ Alizarin Red S (ARS)

1. استنشق وسط الاستزراع من الآبار التي تحتوي على OBs الأولية بعد 14 يوما من إضافة MM وشطفها مرتين ب 0.5 مل من 1x PBS في RT. قم بشفط PBS وإصلاح الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ في RT لمدة 10 دقائق.
2. استنشق الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ باستخدام ماصة تستخدم مرة واحدة واغسلها مرتين ب 0.5 مل من الماء فائق النقاء.
3. إلى OBs الثابتة ، أضف 0.25 مل من محلول تلطيخ ARS 40 ملي مولار (درجة الحموضة 4.2) المذاب في الماء فائق النقاء واحتضان اللوحة عند RT لمدة 10 دقائق على شاكر بمعدل 100 هزة / دقيقة.
4. قم بشفط محلول التلوين باستخدام ماصة تستخدم مرة واحدة واشطفها ب 1 مل من الماء فائق النقاء. كرر هذه الخطوة من 5 إلى 10 مرات لإزالة البقع غير المحددة.
   ملاحظه: يجب أن يكون محلول الشطف بدون لون.
5. استنشق الماء فائق النقاء وأضف 1 مل من PBS البارد. احتضن الطبق في RT لمدة 10 دقائق على شاكر بمعدل 100 هزة / دقيقة.
6. قم بشفط PBS ، وانقل أقراص β-TCP الملطخة إلى بئر جديد ، وامسح الألواح باستخدام ماسح ضوئي مسطح لتسجيل التمعدن.
7. أضف 0.25 مل من محلول كلوريد سيتيل بيريدينيوم بنسبة 10٪ واحتضن اللوحة عند RT لمدة 15 دقيقة على شاكر عند 100 هزة / دقيقة لاستخراج صبغة ARS.
8. انقل المواد الطافية إلى أنبوب سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 17,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
9. أضف محلول كلوريد سيتيل بيريدينيوم بنسبة 10٪ إلى المستخلصات بنسبة تخفيف 1:10-1:20 وأضف العينات (300 ميكرولتر) إلى صفيحة من 96 بئرا بما في ذلك بئران فارغان يحتويان على 10٪ فقط من كلوريد سيتيل بيريدينيوم.
10. قم بإعداد 7 معايير مرجعية ل ARS تتراوح من 4 إلى 400 ميكرومتر عن طريق تخفيف محلول تلطيخ ARS 40 ملي مولار (درجة الحموضة 4.2) بمحلول كلوريد سيتيل بيريدينيوم بنسبة 10٪ لإنشاء منحنى قياسي.
11. أضف 300 ميكرولتر من المعيار المرجعي في نسخ مكررة إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا.
12. اقرأ امتصاص العينات والفراغات والمعايير المرجعية عند 520 نانومتر.
13. اطرح القراءات الفارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.

المواد