مقايسة تنبت الخرزة لتقييم تكوين الأوعية الدموية في المراحل المبكرة: نموذج قائم على الخرزة في المختبر لدراسة إنبات البطانة في وجود الحمضات

الملخص

المصدر: Azam, S. H. et al. دمج الخلايا المحيطة في مقايسة إنبات حبة الخلايا البطانية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو اختبارا معدلا قائما على حبات الناقل الدقيق يتضمن الخلايا المحيطية لدراسة إنبات البطانة خلال المراحل الأولى من تكوين الأوعية. يوفر الاختبار نموذجا تجريبيا في المختبر لفهم الآليات الجزيئية لتكوين الأوعية وتأثير العلاجات المضادة للأوعية الوراثية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخرز لزرع الجل

1. خذ مزرعة تحتوي على حبات حاملة دقيقة مغلفة بالخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) والخلايا المحيطة.
2. افحص الأطباق التي تحتوي على الخرزات المطلية بالناقل الدقيق تحت المجهر باستخدام هدف 20X للتأكد من أن جميع الخرزات قد تم تغطيتها بشكل كاف بواسطة الخلايا البطانية.
3. قم بعمل ماصة بقوة لمحلول الخلايا المطلي لفصلها عن اللوحة التي يبلغ طولها 6 سم ووضع المحلول في أنبوب. اغسل اللوحة 2X مرات إضافية بوسائط كاملة وانقلها إلى الأنبوب لجمع جميع الخرزات المتبقية التي قد تلتصق باللوحة.
   1. تجنب إدخال فقاعات الهواء واستخدم ماصة p1000 لتقليل إجهاد القص على الخرز المطلي بالخلايا البطانية.
4. انتظر 3 دقائق للسماح للحبات الموجودة في المحلول بالاستقرار في قاع الأنبوب.
5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخرزة باستخدام طرف ماصة p1000 (لا تستخدم شفاط التفريغ).
6. أضف 1 مل من الوسائط الكاملة إلى كل أنبوب وأعد تعليق الخرز.
7. انتظر 30-60 ثانية للسماح للخرز بالاستقرار في الأسفل. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج حبيبات الخرزة. لا تستخدم شفاط الفراغ حيث تزداد احتمالية إزالة حبيبات الخرزة عن طريق الخطأ بشكل كبير.
8. كرر الخطوتين 1.6 و1.7 مرتين إضافيتين. الهدف هو إزالة أكبر قدر ممكن من HUVEC العائم الحر الذي ربما تم فصله عن اللوحة التي يبلغ طولها 6 سم ، مع عدم إزالة الكثير من الخرز المطلي ب HUVEC ، والذي يجب أن يستقر في أنابيب فرز الخلايا المنشطة الفلورية ذات القاع المستدير (FACS) بسرعة أكبر من الخلايا العائمة الحرة.
9. أضف 1 مل من الوسائط الكاملة إلى الخرز.

فئة

2. تضمين الخرز المطلي في هلام الفيبرين

1. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط دون إزعاج حبيبات الخرزة في كل أنبوب FACS باستخدام ماصة P1000.
2. أعد تعليق الخرزات في 2.5 مل من محلول الفيبرينوجين.
3. ماصة 13 ميكرولتر من محلول الثرومبين في كل بئر مرغوب فيه من صفيحة ذات قاع زجاجي 24 بئرا. يعد الطلاء في صفيحة ذات قاع زجاجي أمرا ضروريا لتمكين التصوير الأمثل للبراعم.
   ملاحظة: لا تترك الثرومبين جالسا في بئر لأكثر من 5-10 دقائق قبل الخطوة التالية.
4. أضف 0.5 مل من محلول الخرزة / الفيبرينوجين إلى كل بئر.
   1. تأكد من إعادة تعليق محلول الخرزة جيدا قبل سحب المحلول في كل مرة.
   2. توخي الحذر من إدخال الماصة بعناية مباشرة في الثرومبين الموجود بالفعل في البئر. قم بتحريك الماصة ببطء لأعلى ولأسفل 2-3 مرات لخلط المحلول جيدا، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء.
   3. تأكد من تغيير طرف الماصة بين الآبار.
   4. توخي الحذر من عدم تحريك أو إزعاج اللوحة في أي وقت أثناء تخثر الفيبرين الأولي ، لأن أي حركة قد تعطل تكوين الجل.
5. اترك الطبق جالسا في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. انقل اللوحة بحذر إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة إضافية للسماح للجل بالتصلب تماما

فئة

3. طلاء الخلايا الليفية فوق جل الفيبرين

1. خلال آخر 30 دقيقة من تصلب الجل ، افصل الخلايا الليفية الرئوية البشرية الطبيعية (NHLF) على النحو التالي:
   1. اغسل قارورة T175 من الخلايا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم أضف 5 مل من محلول انفصال الخلية واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. أعد تعليق NHLF بتركيز 20,000 خلية / مل في وسائط كاملة.
      ملاحظة: يمكن زراعة خلايا NHLF باستخدام Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) المكملة بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
2. لوحة 1 مل من تعليق خلية NHLF على هلام كل بئر ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
3. قم بتغيير الوسائط الكاملة كل يومين طوال مدة الفحص.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطراف ماصة معقمة VWR الماصات إيبندورف مجموعة كاملة من EGM2 Media Bullet Kit لونزا CC-3162 HUVEC وسائل الإعلام MEM جيبكو 11095114 10T1 / 2 الوسائط DMEM جيبكو 11965118 NHLF وسائل الإعلام PBS من الدرجة لزراعة الأنسجة جيبكو 14190-144 خال من المغنيسيوم والكالسيوم أكوتاز تقنيات الحياة A1110501 لرفع HUVEC التربسين تقنيات الحياة 15050065 لرفع 10T 1/2 و NHLF هوفيك لونزا C2517A 10 طن 1/2 ATCC NHLF ATCC Cytodex 3 حبات microcarrier سيغما سي 3275 ألواح 6 و 10 سم مطلية بزراعة الأنسجة كورنينج الفيبرينوجين من بلازما الأبقار سيغما F8630 الثرومبين سيغما تي 9549 أبروتينين سيغما أ 3428 أنابيب فالكون المستديرة السفلية كورنينج حاضنة زراعة الأنسجة وغطاء المحرك ألواح سفلية زجاجية 24 بئر ماتيك P24G1.513F هناك حاجة إلى ألواح ذات قاع زجاجي فقط إذا كان سيتم تصوير البراعم. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فإن بلاستيك زراعة الأنسجة مقبول أيضا.