مقايسة ملامسة اليرقات: إجراء لتقييم وفيات يرقات البعوض بعد الاتصال المباشر بمركب مبيد اليرقات التجريبي

الملخص

المصدر: Brito-Sierra, C.A., et al. بروتوكولات لاختبار سمية كيمياء المبيدات الحشرية الجديدة للبعوض J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نصف مقايسة ملامسة اليرقات لتقييم سمية مضاد مستقبلات الدوبامين أميتريبتيلين على يرقات المرحلة الثالثة من البعوض ، وهي نواقل معروفة للعديد من الأمراض المعدية البشرية. يساعد تقييم وفيات اليرقات عند الحضانة بتركيزات أميتريبتيلين مختلفة على فترات زمنية مختلفة في تحديد تركيزها المميت 50.

البروتوكول

فئة

1. فحص ملامسة اليرقات (جرعة نقطة واحدة أو مقايسة استجابة الجرعة)

ملاحظة: يمكن إجراء الفحص باستخدام الكيمياء القابلة للذوبان في الماء أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، بشرط ألا يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO في آبار الاختبار 1٪. قد تكون المذيبات البديلة خيارا ، ولكن من الضروري أولا التأكد من أن التركيز النهائي لا يسبب أكثر من 10٪ من الوفيات بعد 72 ساعة من التعرض. يمكن إجراء الفحص كجرعة أحادية النقطة أو مقايسة استجابة الجرعة. في حالة إجراء هذا الأخير ، يوصى باختبار مجموعة من التركيزات (خمسة على الأقل) ، تمتد على LC₅₀ المتوقع.

1. قم بتسمية آبار صفيحة مناديل شفافة مكونة من 24 بئرا.
2. قم بإعداد محلول مخزون من كيمياء الاختبار في أنبوب 1.5 مل.
   1. قم بوزن كل كيمياء باستخدام ميزان تحليلي ، واعتمادا على خصائص الذوبان ، أعد تعليقها في DDH₂O معقم أو DMSO أو مذيب عضوي آخر مناسب من اختيارك.
      ملاحظه: يجب أن تأخذ الحسابات في الاعتبار نقاء الكيمياء. على سبيل المثال ، بالنسبة للكيمياء النقية بنسبة 99٪ ، قم بإذابة 10.1 مجم في 1,000 ميكرولتر من الأسيتون للحصول على محلول 1٪. يغلق بغشاء البارافين ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. تحديد التركيز النهائي لكيمياء الاختبار التي سيتم تقييمها وإعداد التخفيفات التسلسلية من محلول المخزون وفقا لذلك ، باستخدام المذيب المناسب.
   ملاحظه: يمكن حساب تركيز وحجم الكيمياء والمذيبات باستخدام الصيغة C1 * V1 = C2 * V2 حيث C1 = تركيز العينة 1 ، C2 = تركيز العينة 2 ، V1 = حجم العينة 1 و V2 = حجم العينة 2.
   1. قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي مولار وتخفيفات تسلسلية كما هو مطلوب للحصول على تركيزات الاختبار المطلوبة (الجدول 1 ب).
4. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية واسعة التجويف ، انقل خمس يرقات L3 إلى بئر لوحة اختبار زراعة الأنسجة. يمكن التعرف على يرقات L3 بالطول (~ 2.5 - 3.5 مم) وعرض كبسولة الرأس ~ 0.025 مم. قم بإزالة الماء برفق باستخدام ماصة سعة 1 مل واستبدله بالحجم المطلوب من ddH₂O. كرر للحصول على n = 4 مكررات تقنية لكل معالجة (أي إجمالي 20 يرقة لكل معالجة).
5. أضف الحجم المناسب من كيمياء الاختبار إلى كل من الآبار الأربعة المكررة في لوحة الاختبار المكونة من 24 بئرا وقم بتدوير اللوحة برفق لضمان خلط موحد للكيمياء. ضع اللوحة في غرفة اختبار أو نمو في ظل ظروف ثابتة (على سبيل المثال ، يوصى باستخدام 25 درجة مئوية و ~ 75-85٪ رطوبة نسبية ، ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة إن أمكن).
   ملاحظه: من أجل التكاثر بين التجارب ، تأكد من إجراء المقايسات اللاحقة في ظل نفس الظروف البيئية.
6. سجل عدد اليرقات الميتة / غير المستجيبة في كل بئر في 30 دقيقة و 1 و 1.5 و 2 و 3 و 24 و 48 و 72 ساعة بعد التعرض (أو نقاط زمنية بديلة) في ورقة النتائج (الجدول 2). اضغط برفق على جانب اللوحة. إذا لم يلاحظ أي حركة ، فالمس اليرقة برفق باستخدام عود أسنان معقم. سجل اليرقات التي لا تستجيب للنقر / اللمس على أنها "ميتة".
   ملاحظه: يمكن ملاحظة الأنماط الظاهرية المورفولوجية والسلوكية الأخرى ويمكن تسجيلها.
7. تصحيح معدل الوفيات الضابط باستخدام صيغة Abbott المعدلة إذا رغبت في ذلك ، على النحو التالي:
   معدل الوفيات (٪) = (X-Y) * 100 / (100-Y) ،
   حيث X = النسبة المئوية للوفيات في العينة المعالجة ، و Y = النسبة المئوية للوفيات في السيطرة.
8. ينتج الرسم البياني على شكل رسم بياني أو منحنى لوغاريتمي باستخدام برنامج مفضل مثل Graph-pad Prism 6 أو ما شابه ذلك وحساب قيم التركيز المميت (LC) بالنسبة إلى عنصر التحكم.
9. كرر الاختبار باستخدام دفعة منفصلة من البعوض للحصول على n = 3 أو أكثر من التكرارات البيولوجية.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. أمثلة على حسابات الزاعجة المصرية L3 يرقات (A) مقايسة جرعة أحادية النقطة و (B) مقايسة استجابة الجرعة.

A. فحوصات جرعة نقطة واحدة مع ثلاثة كيمياء كيمياء التركيز (400 ميكرومتر) أميتريبتيلين 80 ملي مولار المخزون: 2 مجم من أميتريبتيلين × 98٪ (نقاء المسحوق) × 0.001 جم / 1 مجم × 1 مول / 313.86 جم × 1 لتر / 0.08 مول × 10⁶ ميكرولتر / لتر = 78.06 ميكرولتر من الماء. التخفيف التسلسلي: خفف المخزون 1: 2 مع ddH₂O ثم 1: 4 لتحقيق 10 مللي متر. أضف 40 ميكرولتر من مخزون 10 ملي مولار إلى البئر الذي يحتوي على 960 ميكرولتر من ddH₂0 لتحقيق تركيز نهائي قدره 400 ميكرومتر / بئر. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية من مخزون 10 ملي مولار 1: 2 لتحقيق مخزون 5 ملي مولار و 2.5 ملي مولار و 1.25 ملي مولار و 0.625 ملليمتر. CIS-(z) -flupenthixol 80 ملي مولار المخزون: 2 مجم من رابطة الدول المستقلة (z) flupenthixol × 98٪ (نقاء المسحوق) × 0.001 جم / 1 مجم × 1 مول / 507.44 جم رابطة الدول المستقلة (z) flupenthixol × 1 لتر / 0.08 مول × 10⁶ ميكرولتر / لتر = 48.28 ميكرولتر من الماء. التخفيف التسلسلي: على النحو الوارد أعلاه. أميتراز 80 ملي مولار المخزون: 2 مجم من أميتراز × 0.001 جم / 1 مجم × 1 مول / 293.4 جم من أميتراز × 1 لتر / 0.08 مول × 10⁶ ميكرولتر / 1 لتر = 85.21 ميكرولتر من DMSO (ملاحظة: Amitraz قابل للذوبان فقط في DMSO). التخفيف التسلسلي: على النحو الوارد أعلاه. B. مقايسة استجابة الجرعة الكيمياء الجرعة 1 الجرعة 2 الجرعة 3 الجرعة 4 الجرعة 5 400 ميكرومتر 200 ميكرومتر 100 ميكرومتر 50 ميكرومتر 25 ميكرومتر على سبيل المثال ، أميتريبتيلين ، رابطة الدول المستقلة - (Z) - فلوبنثيكسول أوراميتراز 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر 40 ميكرولتر مخزون 10 ملي متر مخزون 5 ملي 2.5 ملي متر مخزون 1.25 ملي متر مخزون 0.625 ملي متر مخزون < p class = "jove_content" > الجدول 2. مثال على ورقة الدرجات المستخدمة لتسجيل البيانات من مقايسة استجابة جرعة يرقات البعوض. التحكم ، الماء فقط ، أو الماء مع 1٪ DMSO أو مذيب آخر فقط. الجرعات النموذجية المستخدمة لاختبار الكيمياء المضادة للجزيئات الصغيرة مثل أميتريبتيلين هي 25 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر و 400 ميكرومتر.

فحص يرقات البعوض L3 تاريخ البدء: محقق: الأنواع / السلالة: نوع الفحص: جرعة واحدة / استجابة جرعة

1. معدل الوفيات (عدد البعوض الميت)

الوقت (ساعات) الجرعة 1 الجرعة 2 الجرعة 3 الجرعة 4 الجرعة 5 تحكم 0.5 1 1.5 2 2.5 3 12 24 48 72 < td colspan = "7" >

1. النسبة المئوية للوفيات

الوقت (ساعات) الجرعة 1 الجرعة 2 الجرعة 3 الجرعة 4 الجرعة 5 تحكم 0.5 1 1.5 2 2.5 3 12 24 48 72

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سلالات البعوض الحساسة للمبيدات الحشرية أبحاث الملاريا ومستودع مرجع الكاشف https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx. موصى به
السلالات: سلالة الزاعجة المصرية ليفربول (LVP) ، Anopheles gambiae
سلالة Kisumu (KISUMU1) وسلالة Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) أسيتون Mallinckrodt الكيميائية سجل المستخلصات الكيميائية 67-64-1 استخدم للتخفيفات والتحكم أميتراز سيجما ألدريتش 33089-61-1 يتطلب التخفيف في DMSO أميتريبتيلين سيجما ألدريتش سجل المستخلصات الكيميائية: 549-18-8 يمكن تخفيفه في الأسيتون رابطة الدول المستقلة- (Z) - فلوبنثيكسول سيجما ألدريتش سجل المستخلصات الكيميائية: 51529-01-2 تم اختباره دوائيا كمعطل لمستقبلات شبيهة بالمنشطات ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما ألدريتش MKBF2985 مذيب عضوي يستخدم لإذابة أميتراز لوحة زراعة الخلايا 24 بئر مع غطاء كورنينج إنكوربوريتد 3526 نقل الماصات فيشر ساينتيك 13-711-7 م تستخدم لفرز اليرقات مجهر ستيريو أوليمبوس شز6045 تستخدم لتسجيل فحوصات اليرقات وأداء التطبيقات الدقيقة