$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE
< p class = "jove_title" >1. ثقافة البعوض البالغ
ملاحظة: سلالات البعوض الحساسة للمبيدات الحشرية متوفرة من مستودع أبحاث الملاريا ومرجع الكاشف. السلالات الموصى بها هي كما يلي: سلالة الزاعجة المصرية ليفربول (LVP) ، سلالة Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) ، وسلالة Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- استزراع يرقات البعوض من البيض في دورة ليلية مدتها 12 ساعة في النهار / 12 ساعة عند 28 درجة مئوية و 75-85٪ رطوبة نسبية (RH) في صواني بلاستيكية مقاس 25 سم × 40 سم (~ 400 يرقة لكل صينية) كما وصفها نوس. إطعام اليرقات الجربوع المطحونة (A. aegypti و An. gambiae) أو طعام أسماك رقائق (C. quinquefasciatus). بالنسبة لمقايسات اليرقات ، اجمع اليرقات في مرحلة اليرقة الثالثة (L3).
- قم بتربية البعوض البالغ من الشرانق التي تم نقلها إلى أكواب بلاستيكية ووضعها داخل أقفاص بلاستيكية سعة 20 لترا في حشرة في ظل الظروف الموضحة أعلاه. حافظ على البعوض على محلول سكر بنسبة 20٪ كما هو موضح في مكان آخر. اجمع البالغين بعد 3-5 أيام من ظهورهم.
< p class = "jove_title" >2. الفحص الموضعي للبالغين (جرعة واحدة أو مقايسة استجابة الجرعة)
ملاحظة: يتم إجراء الفحص الموضعي للبالغين باستخدام الأسيتون كمذيب. قد تكون المذيبات البديلة خيارا ، ولكن من الضروري أولا التأكد من أن التركيز النهائي لا يسبب أكثر من 10٪ من الوفيات بعد 48 ساعة من التعرض. يمكن إجراء الفحص كجرعة أحادية النقطة أو مقايسة استجابة الجرعة ويستخدم لتحديد الجرعة المميتة (LD). في حالة إجراء هذا الأخير ، يوصى باختبار مجموعة من التركيزات (بحد أدنى خمسة) ، تمتد على LD50 المتوقع.
- تحديد عدد إناث البعوض البالغة المطلوبة لإكمال الفحص.
ملاحظه: سيتطلب اختبار الجرعة النقطية مع كيمياء واحدة ما لا يقل عن 90 بعوضا (30 للتحكم الإيجابي ، و 30 للتحكم السلبي الأسيتون فقط ، و 30 لكيمياء الاختبار).
- استزراع إناث البعوض البالغة التي تتراوح أعمارها بين 3 و 5 أيام وانتقل إلى دلو بلاستيكي منفصل سعة 20 مل باستخدام شفاط (الشكل 1).
- قم بتسمية أكواب ورقية سعة 9 أونصات باسم وتركيز كيمياء الاختبار. ضع جانبا مربعات شبكية وأربطة مطاطية مقاس 10 سم × 10 سم لكل كوب (انظر الشكل 2).
- حدد مبيدا حشريا موجودا كعنصر تحكم إيجابي (على سبيل المثال ، البيرثرويد الاصطناعي ، البيفنثرين) وقم بإعداد محلول مخزون بنسبة 1٪ (10 ميكروغرام / ميكرولتر) في الأسيتون.
ملاحظة: يجب أن تأخذ الحسابات في الاعتبار نقاء الكيمياء. على سبيل المثال ، بالنسبة للكيمياء النقية بنسبة 99٪ ، قم بإذابة 10.1 مجم في 1,000 ميكرولتر من الأسيتون للحصول على محلول 1٪. يغلق بغشاء البارافين ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- باستخدام نفس الإجراء المذكور أعلاه ، قم بإعداد محلول مخزون لكيمياء الاختبار.
ملاحظه: العديد من كيمياء الاختبار قابلة للتغيير بدرجة كبيرة ، ويفضل أن تكون المحاليل طازجة في كل مرة يتم فيها إجراء الاختبار الحيوي.
- قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للتحكم الإيجابي واختبار الكيمياء من محاليل المخزون كما هو موضح في الشكل 3 باستخدام قوارير زجاجية سعة 20 مل تم شطفها مسبقا بالأسيتون.
- قم بتطهير حقنة زجاجية سعة 1 مل بالأسيتون ، واملأها بالأسيتون ، وثبتها في أداة التطبيق الدقيقة المعدلة لتقديم حجم 0.25 ميكرولتر.
- العمل على دفعات من عشرة ، قم بإزالة إناث البعوض البالغة البالغة من 3 إلى 5 أيام من الأقفاص باستخدام شفاط وتخدير لمدة تصل إلى خمس دقائق عند 4 درجات مئوية في الثلاجة أو على الثلج. بعد ذلك ، انقل البعوض إلى طبق بتري وضعه على الثلج لمدة تصل إلى 10 دقائق.
- العمل بسرعة ، قم بإزالة أنثى واحدة بملاقط دقيقة ، وقم بتطبيق 0.25 ميكرولتر من محلول الاختبار على الصدر الظهري باستخدام قضيب الحقنة الدقيقة. تأكد من توصيل الكيمياء عن طريق الملاحظة باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أن كل بعوضة تتلقى الحجم المناسب من كيمياء الاختبار.
- انقل البعوضة إلى كوب ورقي مكتوب عليه تسريح على الجليد ، وكرر ذلك تسع مرات للحصول على n = 10 بعوض معالج. أغلق البعوض في الكوب بمربع شبكي مثبت بشريط مطاطي ، وانقله إلى حوض بلاستيكي أو غرفة نمو في ظل ظروف ثابتة تبلغ 28 درجة مئوية و 75-85٪ رطوبة نسبية (يفضل في دورة 12 ساعة في النهار / 12 ساعة ليلية).
- كرر التجربة المذكورة أعلاه مرتين للحصول على n = 3 مكررات تقنية (أي إجمالي 30 بعوضا) لكل مجموعة معالجة أو مجموعة تحكم.
- كرر الخطوات 2.7 - 2.10 أولا مع كيمياء الاختبار ثم التحكم الإيجابي.
ملاحظه: عنصر تحكم مفيد آخر يجب تضمينه في حالة توفر عدد كاف من البعوض هو "فراغ" من 30 بعوضا مخدرا لا يتلقى كيمياء الاختبار أو المذيب.
- سجل عدد البعوض "الميت/غير المستجيب" بعد 30 دقيقة و 60 دقيقة و 2 و 24 و 48 ساعة بعد التعرض (أو نقاط زمنية بديلة) باستخدام ورقة النتائج (الجدول 1). قم بتسجيل البعوض على أنه "ميت / غير مستجيب" إذا أظهر نقصا في الحركة ، ويعرف بأنه مستلقي على جانب واحد أو على الظهر وعدم القدرة على الطيران.
- إذا رغبت في ذلك ، قم بتصحيح معدل الوفيات الضابط باستخدام صيغة Abbott المعدلة على النحو التالي:
معدل الوفيات (٪) = (X-Y) * 100 / (100-Y) ،
حيث X = النسبة المئوية للوفيات في العينة المعالجة ، و Y = النسبة المئوية للوفيات في السيطرة.
- عرض النتائج كرسم بياني أو منحنى أسي. لمقايسة استجابة الجرعة ، احسب قيمة LD50 أو LD75 أو LD90 لكيمياء الاختبار بالنسبة إلى عنصر التحكم.
- كرر الاختبار مرتين على الأقل باستخدام دفعات منفصلة من البعوض للحصول على n = 3 أو أكثر من التكرارات البيولوجية.
