$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. إنتاج فيروس العدسات
ملاحظة: تم إنتاج ومعالجة نواقل الفيروسات العدسية وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) للبحث الذي يتضمن الحمض النووي المؤتلف. يتم استخدام البلازميد الذي يشفر SOD1 المتحور من النوع البري و A4V الموسومة ب YFP المحسن (SOD1WT-YFP و SOD1A4V-YFP). تم تضخيم كلا منتجي الاندماج الجيني باستخدام زوج التمهيدي PCR 5′-ATCGTCTAGACCATGGCGACGAAGGTCGTGC-3 ′ و 5′-TAGCGG CCGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ وإدخالها في بلازميد pTRIP-delta U3 CMV باستخدام مواقع تقييد XhoI و BsrGI. يساعد تجنب أكثر من 20 ممرا والحفاظ على الخلايا عند التقاء أقل من 60٪ على ضمان كفاءات تعداء جيدة.
- في اليوم 1 ، قم بتقسيم خلايا HEK-293T عند التقاء 30 - 40٪ في صفيحة زراعة أنسجة قطرها 10 سم (3 × 10 خلايا / طبق) في 10 مل من وسط زراعة الخلايا (DMEM عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS و 4 ملي مولار ل-جلوتامين) لإنتاج الفيروسات.
- احتفظ بلوحة زراعة الأنسجة التي يبلغ قطرها 10 سم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) طوال الليل.
- في اليوم 2 ، قم بإعداد محلول تعداء الحمض النووي يحتوي على 10 ميكروغرام من نواقل الفيروسات العدسية (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP أو -SOD1A4V-YFP) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة الفيروسية العدسية (5 ميكروغرام من pVSVg ؛ 10 ميكروغرام من pCMV-dR8.71) (الشكل 1 أ). أضف 125 ميكرولتر من 1 M CaCl₂ واضبط الحجم على 500 ميكرولتر باستخدام الماء المقطر. أضف برفق 500 ميكرولتر من 0.05 M HEPES إلى الخليط واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استبدل وسط خلايا HEK-293T ب 10 مل من وسط الاستزراع الطازج المسخن مسبقا الخالي من المضادات الحيوية الممزوج بمحلول تعداء الحمض النووي سعة 1 مل واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- في اليوم 3 ، استبدل المادة الطافية للخلية بوسط مزرعة طازجة.
- في اليوم 4 ، احصد المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم لإزالة الخلايا الميتة والحطام. قم بتنقية المادة الطافية بشكل أكبر عن طريق تمريرها عبر مرشح 0.45 ميكرومتر باستخدام حقنة كبيرة سعة 60 مل. استغنى على الفور في حصص تستخدم مرة واحدة (300 ميكرولتر) ، وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. للحفاظ على أقصى نشاط للمنتج ، تجنب دورة التجميد والذوبان.
< p class = "jove_title" >2. نقل الفيروسات العدسية
- قم بتقسيم خط الخلية المراد إصابته عند التقاء 60٪ (خلايا HEK-293 و SH-SY5Y ؛ 5 × 10 خلايا لكل بئر و U2OS ؛ 1 × 10 خلايا لكل بئر) في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار في 2 مل من وسائط DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS.
- احتفظ بلوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار في حاضنة 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.
- قم بإزالة فيروس العدسات المجمد من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة كمية من البكوت على الثلج قبل كل استخدام ؛ لا تقم بإعادة التجميد.
- أثناء ذوبان الفيروس ، قم بتسخين وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على المصل المتوافق مع خط الخلية محل الاهتمام. بمجرد إذابة الفيروس بالكامل ، قم بإعداد مجموعة من التخفيفات (1: 3 و 1:10 و 1:30 و 1: 100) في DMEM في أنبوب ميكرو فيوج جديد سعة 1.5 مل.
- ارفع الحجم في الأنابيب إلى 1 مل مع وسائط مصل مخفضة.
- أضف 2 ميكرولتر من البوليبرين (في مخزون 4 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 1 مل من الفيروس / الوسائط. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات وتضاف 1 مل من الخليط إلى الخلايا. احتضان الخلايا بالفيروس لمدة 24 ساعة.
- قم بإزالة وسائط الفيروسات واستبدلها بوسائط DMEM عادية مكملة بنسبة FBS بنسبة 10٪. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- راقب نمو الخلايا وقم بتغيير وسائط الثقافة كل يومين. عند التقاء ، قم بتوسيع الطبق المكون من 6 آبار إلى صفيحة زراعة الأنسجة بقطر 10 سم.
- بمجرد توسيع الخلايا بشكل كاف ، قم بزرع 1.5 × 10⁴ خلية لكل بئر في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM على 384 لوحة فحص بئر للتحقق من مستوى التعبير عن البروتين الموسوم ب YFP عن طريق الفحص المجهري. إذا أظهر تعبير الخلية البروتينية الموسومة ب YFP نسبة إشارة إلى ضوضاء ≥3 ، فقم بإعداد مخزون الخلية لخط الخلية المقابل.
< ص الفئة = "jove_title" >3. التأثير المعتمد على الوقت لمثبط البروتيازوم على تراكم البروتين
ملاحظة: قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام مجهر آلي (انظر المواد).
- قم بتوزيع 0.25 ميكرولتر من DMSO أو مثبط البروتيازوم المذاب في DMSO بنسبة 100٪ (ALLN ، 2 ملليمتر) على ألواح قاع مسطحة 384 بئر.
- قم بزرع 1.5 × 104 خلايا يدويا لكل بئر في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM على نفس لوحة الفحص. يجب أن يكون التركيز النهائي لمثبط البروتيازوم (ALLN) 10 ميكرومتر.
- قم بإعداد وحدة التحكم البيئي لنظام المجهر إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تظهر لقطة شاشة للإعداد التجريبي في الشكل 2.
- قم بتشغيل المجهر في وضع تألق المجال الواسع ، باستخدام البرنامج بالإعدادات التالية: هدف LWD 20X ، الوضع غير متحد البؤر ، 4 حقول / بئر ، مع فاصل التقاط مدته ساعة. في نهاية كل تشغيل، يتم تحميل الصور الملتقطة تلقائيا إلى الخادم.
< p class = "jove_title" >4. تصوير الفاصل الزمني للتعبير YFP في الخلايا الحية ، وتحليل الصور (قناة واحدة)
ملاحظة: تصف الخطوات التالية تطبيق البرنامج (على سبيل المثال، كولومبوس).
- حدد الخوارزمية المناسبة لتقسيم الكائنات الأساسية (العصارة الخلوية والتجميع). إذا لزم الأمر ، اضبط عتبة الخلفية ومعلمات التباين (الشكل 3).
- عد الخلايا باستخدام "البحث عن الخلايا" بحد فردي يبلغ 0.1 لقناة شدة YFP. حدد المجاميع باستخدام خوارزمية "العثور على البقع" بكثافة بقعة YFP نسبية >0.2 ومعامل تقسيم 1.0.
< ص الفئة = "jove_title" >5. تأثير استجابة الجرعة لمثبطات البروتيازوم على تراكم البروتين على الخلايا الحية الملطخة بنواتها (قناتان)
ملاحظة: قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام مجهر آلي. تحديد نطاق تركيز مثبطات البروتيازوم (ALLN و Epoxomicin و MG132) بناء على قيمة IC50 المتوقعة لضمان ملاءمة المنحنى المثلى.
- قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للمركبات على صفيحة بولي بروبلين تخزين 384 بئرا بواسطة سلسلة التخفيف القياسية 1: 3. تأكد من خلط التخفيفات المركبة جيدا للتأكد من دقة تركيزات المركب.
- قم بتوزيع 0.25 ميكرولتر من مثبطات البروتيازوم على ألواح فحص سوداء مسطحة القاع 384 بئر. نحن نستخدم معالج سائل مزود برأس شعري 384 قادر على نقل الأحجام.
- بذرة 1.5 × 1010⁴ خلية لكل بئر في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM على ألواح الفحص. احتضان ألواح الفحص عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
- أضف 10 ميكرولتر من وسائط DMEM (دافئة مسبقا عند 37 درجة مئوية) بمحلول تلطيخ (Hoechst 33342 بمخزون 10 مجم / مل) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- قم بتشغيل برنامج تشغيل المجهر. تظهر لقطة شاشة للإعداد التجريبي في الشكل 4. حدد علامة التبويب "التكوين" وحدد هدف 20X ونوع اللوحة الصحيح. تأكد من ضبط "طوق" على القيمة الصحيحة على الهدف مما يسمح بالتركيز المناسب مع أنواع مختلفة من الألواح.
- حدد علامة التبويب "المجهر". حدد التعريض الضوئي 1 على أنه YFP (488 ليزر) والتعرض 2 على أنه Hoechst (405 ليزر). قم بتنشيط الفلتر على كلتا التعريضات الضوئية وقم بتعيين التعريض الضوئي 1 للكاميرا 1 والتعريض الضوئي 2 للكاميرا 2. اضبط أوقات التعريض الضوئي على ~ 800 مللي ثانية للتعريض الضوئي 1 و ~ 40 مللي ثانية للتعريض الضوئي 2.
- حدد التعريض الضوئي 1. اضبط ارتفاع التركيز البؤري على 0 ميكرومتر. حدد "التركيز". بمجرد التركيز ، قم بتعريض الكاميرا 1. اضبط ارتفاع التركيز البؤري لتحسين مستوى التعريض الضوئي وانقر على "أخذ الارتفاع". قم بتغيير أوقات التعرض وقوة الليزر لإعطاء أقصى كثافة بكسل تبلغ ~ 3,000. حفظ معلمات التعريض الضوئي. كرر للتعرض 2.
- حدد علامة التبويب "تعريف التجربة". أنشئ تخطيطا وتخطيطا فرعيا. قم بسحب وإسقاط التخطيط والتعرض والصورة المرجعية وملف skewcrop والتخطيط الفرعي ذي الصلة. احفظ التجربة.
- حدد علامة التبويب "التجربة التلقائية" واحصل على الصور. في نهاية كل تشغيل، يتم تحميل الصور الملتقطة تلقائيا إلى الخادم.
6. تحليل الصور لصورتين من القنوات
- حدد خوارزمية البرنامج لتقسيم الكائنات الأساسية (النوى ، العصارة الخلوية ، والمجاميع) (الشكل 5).
- حدد الطريقة التي تقسم النوى بدقة عن طريق الفحص البصري للكائنات المجزأة. سيتم استخدام الأجسام الملطخة ب Hoechst في القناة 1 (Ch1) لتحديد عدد الخلايا. سيتم استخدام تلطيخ YFP من SOD1-A4V المتحور في القناة 2 (Ch2) لتحديد كمية الركام.
- عد الخلايا باستخدام خوارزمية "البحث عن النوى" كمناطق تلطيخ Hoechst >20 ميكرومتر مربع ، بعامل انقسام 7.0 ، وعتبة فردية تبلغ 0.40 ، وتباين >0.10.
- قم بإنشاء جدول البيانات وتحديد EC50 لكل مركبة باستخدام معادلة "الانحدار غير الخطي" في برنامج الرسوم البيانية.
