مقايسة محللة الخلايا الأميبينية المضطربة: تقنية للكشف عن تلوث السموم الداخلية وقياسها في الأدوية النانوية

الملخص

المصدر: Neun، B. W. et al.، الكشف عن السموم الداخلية في تركيبات النانو باستخدام فحوصات Limulus Amoebocyte Lysate (LAL). J. Vis. إكسب. (2019)

يصف هذا الفيديو الشكل العكر لمقايسة Limulus amoebocyte ، أو LAL ، لتقدير تلوث السموم الداخلية في تركيبات دوكسوروبيسين النانوية الشحمية PEGylated. تساعد تعكر المحلول بعد تفاعل السم الداخلي مع كاشف LAL على تقدير السم الداخلي في العينة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير عينات الجسيمات النانوية

1. تحضير عينة الدراسة في ماء من الدرجة LAL.
2. إذا كان الرقم الهيدروجيني للعينة خارج نطاق 6-8 ، فاضبط الأس الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الخالي من البيروجين أو حمض الهيدروكلوريك.
3. باستخدام الماء من الدرجة LAL ، قم بإعداد عدة تخفيفات لعينة الدراسة. تأكد من أن أعلى تخفيف لا يتجاوز الحد الأقصى للتخفيف الصالح (MVD).

2. تحضير الكواشف الشائعة بين تنسيقات LAL

قم
1. بتخفيف مخزون هيدروكسيد الصوديوم المركز باستخدام ماء كاشف LAL الخالي من البيروجين لتحضير محلول عملي بتركيز 0.1 نيوتن.
قم
2. بتخفيف مخزون حمض الهيدروكلوريك المركز باستخدام ماء كاشف LAL الخالي من البيروجين وإعداد محلول عامل بتركيز نهائي قدره 0.1 نيوتن.
3. تحضير السموم الداخلية القياسية للتحكم (CSE)
   1. أعد تكوين CSE وفقا لشهادة التحليل المقدمة من الشركة المصنعة.
      ملاحظه: ارجع إلى جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة برقم الكتالوج وتطبيق صيغة CSE معينة بتنسيقات LAL مختلفة.
4. تحضير كاشف LAL
   1. أعد تكوين كاشف LAL وفقا لشهادة التحليل المقدمة من الشركة المصنعة.
      ملاحظه: ارجع إلى جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة برقم الكتالوج وتطبيق تركيبة كاشف LAL معينة بتنسيق LAL مختلف.

< p class = "jove_title" >3. فحص التعكر LAL

1. إعداد معايير المعايرة
   1. باستخدام 900 ميكرولتر من الماء من الدرجة LAL و 100 ميكرولتر من CSE ، قم بإعداد أكبر عدد ممكن من التخفيفات الوسيطة حسب الحاجة لتمكين إعداد معيار معايرة بنطاق تركيز من 0.001 إلى 1 EU/mL.
   2. قم أولا بوضع الملصقات على الأنابيب وأضف 900 ميكرولتر من الماء من الدرجة LAL إلى كل أنبوب. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول 10 EU/مل لإعداد معيار المعايرة بتركيز 1EU/mL.
   3. كرر التخفيف التسلسلي بمقدار 10 أضعاف كما هو موضح أعلاه لإعداد ثلاثة معايير معايرة أقل. تحقق من إعداد أربعة معايير معايرة تتراوح من 0.001 إلى 1 EU/mL.
2. إعداد ضوابط الجودة
   1. قم بإعداد مراقبة جودة 0.05 EU/mL عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من محلول CSE 1 EU/mL مع 950 ميكرولتر من الماء من الدرجة LAL.
3. تحضير ضوابط التثبيط / التعزيز (IEC)
   1. قم بإعداد IEC بتركيز 0.05 EU/مل عن طريق الجمع بين 25 ميكرولتر من محلول CSE 1 EU/mL و 475 ميكرولتر من مادة الاختبار النانوية عند تخفيف معين.
4. الإجراء التجريبي
   1. اسمح للأداة بالتسخين عن طريق تشغيلها قبل 30 دقيقة تقريبا. قم بإعداد الطول الموجي للكشف إلى 660 نانومتر لأن هذا مناسب للتعكر LAL.
   2. قم بتسجيل الدخول عن طريق كتابة اسم المستخدم وكلمة المرور.
   3. افتح البرنامج (جدول المواد) بالنقر فوق الرمز المقابل على شاشة الكمبيوتر.
   4. حدد تجميع البيانات على الشاشة الرئيسية للبرنامج. أدخل معرف الاختبار ومعلومات مجموعة البيانات في المساحة المقابلة في علامة التبويب عام على الشاشة الرئيسية.
   5. انقر فوق علامة التبويب الأجهزة. اختر نوع الأداة من القائمة المنسدلة.
   6. قم بإعداد الطول الموجي للكشف إلى 660 نانومتر لأن هذا مناسب للتعكر LAL عن طريق اختيار طريقة التعكر LAL.
   7. تحقق من ظهور رقم تسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي على الشاشة. انقر فوق موافق. انقر فوق موافق مرة أخرى للتأكيد.
   8. أدخل معرف العينة بنفس ترتيب اختبار العينة. استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال عنصر التحكم السلبي والمنحنى القياسي وعينات الاختبار.
   9. قم بإعداد أنابيب مكررة لكل عينة وأضف 200 ميكرولتر (نسبة الاختبار 4: 1) أو 100 ميكرولتر (نسبة الاختبار 1: 1) من التحكم السلبي (الماء) ، ومعايير المعايرة ، ومراقبة الجودة ، و IEC ، واختبار الجسيمات النانوية في أنابيب زجاجية مسبقة العلامات.
   10. أضف 50 ميكرولتر (نسبة الاختبار 4: 1) أو 100 ميكرولتر (نسبة الاختبار 1: 1) من كاشف LAL لقارورة الاختبار الأولى ، وقم بدوامها لفترة وجيزة ، وإدخالها في فتحة الاختبار في دائري الأداة. إذا تم استخدام نسبة 1: 1 ، فإن حجم كاشف LAL هو 100 ميكرولتر.
   11. كرر الإجراء الموضح أعلاه للعينات الأخرى. معالجة العينات واحدة تلو الأخرى.
        

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات هيدروكسيد الصوديوم سيغما S2770 عند الحاجة ، يتم استخدامه لضبط درجة الحموضة للعينة لتكون بين 6-8 حمض الهيدروكلوريك سيغما H9892 عند الحاجة ، يتم استخدامه لضبط درجة الحموضة للعينة لتكون بين 6-8 كاشف LAL شركاء كيب كود تي 0051 يمكن استخدام هذا الكاشف مع مقايسة التعكر فقط معيار التحكم في السموم الداخلية شركاء كيب كود E0005 يمكن استخدام هذا الكاشف مع فحوصات التعكر والجلطة الهلامية LAL الصف المياه شركاء كيب كود ال ب 0501 يمكن استخدام هذا الكاشف مع أي تنسيق LAL جلوكاشيلد عازلة شركاء كيب كود جيجابايت051-25 يستخدم لمنع الاستجابة الإيجابية الكاذبة من بيتا جلوكان أنابيب تخفيف زجاجية خالية من السموم الداخلية يمكن التخلص منها 12 × 75 مم شركاء كيب كود تي بي 240 يمكن استخدام هذه الأنابيب مع جميع المقايسات الثلاثة أنابيب تفاعل زجاجية خالية من السموم الداخلية يمكن التخلص منها 8 × 75 مم شركاء كيب كود TK100 يمكن استخدام هذه الأنابيب مع فحوصات التعكر واللونون أطراف خالية من البيروجين بأحجام 0.25 و 1.0 مل رينين PPT25 ، PPT10 قد تمتص الأطراف والماصات السموم الداخلية وتطلق المواد القابلة للترشيح التي تتداخل مع مقايسة LAL. يتم استخدام أطراف RAININ هذه لأنه تم التحقق من أدائها الأمثل في مقايسة LAL وتأكيدها أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من البيروجين، 2.0 مل إيبندورف 22600044 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة كومبيتيبس بيروجين ، 5 مل إيبندورف 30089669 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة كرر الماصة إيبندورف 4982000020 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة ميكروسيتريفوج أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية ثلاجة ، 2-8 درجة مئوية أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية دوار أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية فريزر ، -20 درجة مئوية أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية قارئ Pyros Kinetix أو Pyros Kinetix Flex شركاء كيب كود PKF96 يمكن استخدام أدوات أخرى. ومع ذلك ، قد تتطلب كواشف LAL ومعايير السموم الداخلية المستخدمة في هذا الاختبار التحسين. عند استخدام أجهزة أخرى ، يرجى الرجوع إلى الشركات المصنعة للأداة ومجموعة LAL للحصول على التعليمات