مقايسة محللة الخلايا الأميبينية للجلطة الهلامية: طريقة للكشف عن السموم الداخلية البكتيرية في تركيبات الجسيمات النانوية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Neun، B. W. et al. ، الكشف عن السموم الداخلية في تركيبات النانو باستخدام فحوصات Limulus Amoebocyte Lysate (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو مقايسة جلطة هلامية لتحديد وجود السموم الداخلية البكتيرية في تركيبات النانو باستخدام Limulus Amoebocyte Lysate المشتقة من خلايا دم سرطان حدوة الحصان. يساعد الاختبار في اختبار تلوث السموم الداخلية للمنتجات الصيدلانية ، بما في ذلك التركيبات القائمة على النانو.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير عينات الجسيمات النانوية

1. تحضير عينة الدراسة في ماء من الدرجة LAL.
2. إذا كان الرقم الهيدروجيني للعينة خارج نطاق 6-8 ، فاضبط الأس الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الخالي من البيروجين أو حمض الهيدروكلوريك.
3. باستخدام الماء من الدرجة LAL ، قم بإعداد عدة تخفيفات لعينة الدراسة. تأكد من أن أعلى تخفيف لا يتجاوز الحد الأقصى للتخفيف الصالح (MVD).

2. تحضير الكواشف الشائعة بين تنسيقات LAL

قم
1. بتخفيف مخزون هيدروكسيد الصوديوم المركز باستخدام ماء كاشف LAL الخالي من البيروجين لتحضير محلول عملي بتركيز 0.1 نيوتن.
قم
2. بتخفيف مخزون حمض الهيدروكلوريك المركز باستخدام ماء كاشف LAL الخالي من البيروجين وإعداد محلول عامل بتركيز نهائي قدره 0.1 نيوتن.
3. تحضير السموم الداخلية القياسية للتحكم (CSE)
   1. أعد تكوين CSE وفقا لشهادة التحليل المقدمة من الشركة المصنعة.
      ملاحظه: ارجع إلى جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة برقم الكتالوج وتطبيق صيغة CSE معينة بتنسيقات LAL مختلفة.
4. تحضير كاشف LAL
   1. أعد تكوين كاشف LAL وفقا لشهادة التحليل المقدمة من الشركة المصنعة.
      ملاحظه: ارجع إلى جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة برقم الكتالوج وتطبيق تركيبة كاشف LAL معينة بتنسيقات LAL مختلفة.

فئة

3. جل جلطة LAL

ملاحظة: يحدد هذا الاختبار وجود السموم الداخلية في العينة بناء على الملاحظة البصرية واكتشاف جلطة في أنبوب التفاعل. الخطوات التجريبية موصوفة أدناه. استخدم ورقة مقاعد البدلاء لتسجيل النتائج. ورقة مقاعد البدلاء هذه ليست إلزامية ، كما أن الطرق الأخرى لتسجيل نتائج الفحص مقبولة أيضا. يتم توفير مثال على ورقة مقاعد البدلاء هذه في مواد تكميلية لراحة القارئ. لامدا (ل) هي حساسية مقايسة جلطة الهلام وهي 0.03 يورو / مل.

1. قم بتسمية أكبر عدد ممكن من أنابيب التفاعل حسب الحاجة لاستيعاب عدد عينات الاختبار التي تم تحليلها. ارجع إلى ورقة مقاعد البدلاء للحصول على تفاصيل حول عدد التكرارات المستخدمة في الخطوة 1 والخطوة 2 والخطوة 3 من المقايسة.
2. Aliquot 100 ميكرولتر من الماء أو أدوات التحكم أو عينة الاختبار لكل أنبوب.
3. قم بإعداد CSE بحيث يكون التركيز النهائي مساويا ل 4λ.
4. اجمع بين 100 ميكرولتر من المعيار المذكور أعلاه مع 100 ميكرولتر من الماء أو عينة الاختبار لتحقيق التركيز النهائي ل CSE البالغ 2λ. كرر ثلاث مرات أخرى لتحقيق لامدا ونصف لامدا وربع لامدا.
5. تأكد من أن درجة الحرارة في الحمام المائي 37 درجة مئوية.
6. أضف 100 ميكرولتر من المحللة لكل أنبوب اختبار ، دوامة لفترة وجيزة ، وضع الرف مع جميع الأنابيب في الحمام المائي لمدة 1 ساعة.
7. اقلب الأنبوب بحركة سلسة.
8. سجل النتائج يدويا باستخدام "+" (جلطة ثابتة) أو "-" (بدون جلطة أو جلطة سائبة) على ورقة المقعد.
9. تابع التحليل وفقا ل USP BET 85 ؛ استخدم ورقة مقاعد البدلاء كمواد داعمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كاشف LAL شركاء كيب كود جي 5003 هذا الكاشف خاص بمقايسة الجلطة الهلامية معيار التحكم في السموم الداخلية شركاء كيب كود E0005 يمكن استخدام هذا الكاشف مع فحوصات التعكر والجلطة الهلامية هيدروكسيد الصوديوم سيغما S2770 عند الحاجة ، يتم استخدامه لضبط درجة الحموضة للعينة لتكون بين 6-8 حمض الهيدروكلوريك سيغما H9892 عند الحاجة ، يتم استخدامه لضبط درجة الحموضة للعينة لتكون بين 6-8 LAL الصف المياه شركاء كيب كود ال ب 0501 يمكن استخدام هذا الكاشف مع أي تنسيق LAL المخزن المؤقت Glucashield شركاء كيب كود جيجابايت051-25 يستخدم لمنع الاستجابة الإيجابية الكاذبة من بيتا جلوكان أنابيب تخفيف زجاجية خالية من السموم الداخلية يمكن التخلص منها 12 × 75 مم شركاء كيب كود تي بي 240 يمكن استخدام هذه الأنابيب مع جميع المقايسات الثلاثة أنابيب تفاعل زجاجية خالية من السموم الداخلية يمكن التخلص منها 10 × 75 مم شركاء كيب كود تي إس050 هذه الأنابيب مخصصة للاستخدام مع اختبار الجلطة الهلامية أطراف خالية من البيروجين بأحجام 0.25 و 1 مل رينين PPT25 ، PPT10 قد تمتص الأطراف والماصات السموم الداخلية وتطلق المواد القابلة للترشيح التي تتداخل مع مقايسة LAL. يتم استخدام أطراف RAININ هذه لأنه تم التحقق من أدائها الأمثل في مقايسة LAL وتأكيدها أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من البيروجين، 2.0 مل إيبندورف 22600044 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة كومبيتيبس بيروجين ، 5 مل إيبندورف 30089669 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة كرر الماصة إيبندورف 4982000020 يمكن استخدام مستلزمات أخرى مكافئة ميكروسيتريفوج أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية ثلاجة، 2-8 درجة مئوية أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية دوار أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية فريزر ، -20 درجة مئوية أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية حمام مائي ، 37 درجة مئوية أي علامة تجارية يمكن استخدام أي علامة تجارية ، ومع ذلك ، من المهم إما إيقاف تشغيل دوران المياه أو استخدام حمام مائي غير متداول لأن تدفق المياه سيؤثر على تكوين الجلطة ويؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة