$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تنشيط لوحة مجموعة الفحص
- قم بتنشيط لوحة مجموعة الفحص المكونة من 96 بئرا (التي تحتوي على CPH-xylan الأزرق) (قائمة المواد) عن طريق إضافة محلول تنشيط 200 ميكرولتر (تم الحصول عليه باستخدام المجموعة) في كل بئر ، متبوعا بحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك.
- قم بتطبيق الفراغ باستخدام مشعب فراغ (مع وجود كتلة فاصل بالداخل وأي لوحة قياسية شفافة ذات 96 بئرا كلوحة تجميع) لإزالة محلول التنشيط الموجود. من الممكن أيضا استخدام جهاز طرد مركزي عند 2,700 × جم لمدة 10 دقائق لهذه الخطوة بدلا من مشعب التفريغ.
- اغسل ركائز CPH بإضافة 100 ميكرولتر من الماء المعقم وقم بتطبيق فراغ (أو قوة طرد مركزي) لإزالة المثبت. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وأصبحت الألواح جاهزة الآن للاستخدام.
< p class = "jove_title" >2. تفاعل الإنزيم
ملاحظة: قم دائما بتضمين المخزن المؤقت وحده كعنصر تحكم سلبي وإذا أمكن تم وصف الإنزيمات مسبقا بأنها عناصر تحكم إيجابية. استخدم عددا مناسبا إحصائيا من التكرارات. ركائز CPH مستقرة بين الرقم الهيدروجيني 3.0 إلى 10.0 ويجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لمحلول إنزيم الطرف العازلة في كل بئر 180 ميكرولتر. يمكن أيضا استخدام مستخلص النبات أو مرق الاستزراع بدلا من محلول الإنزيم المنقى.
- أضف 150 ميكرولتر 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 4.5 ، و 5 ميكرولتر محلول السليولاز الداخلي (إلى تركيز نهائي قدره 1 وحدة / مل) إلى كل بئر من لوحة مجموعة الفحص.
- ضع لوحة المنتج (لوحة بئر شفافة متوافقة مع قارئ اللوحة الميكروتيتر) أسفل لوحة مجموعة الفحص لتجميع أي تسرب محتمل من لوحة التفاعل أثناء الاهتزاز.
- احتضان لوحة مجموعة الفحص عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في شاكر أفقي عند 150 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يعد خلط التفاعل في لوحة مجموعة الفحص أثناء الحضانة أمرا بالغ الأهمية لتحقيق نتيجة متسقة وقابلة للتكرار. ركائز CPH مستقرة حتى 90 درجة مئوية. يجب زيادة وقت الحضانة حتى 24 ساعة عند اختبار مرق الاستزراع الذي يحتوي على تركيزات إنزيم غير معروفة مع ركائز CPH. لاحظ أن أوقات الحضانة المناسبة تعتمد على نشاط الإنزيم (الإنزيمات) ، ولكن بشكل عام ، إذا لم يكن هناك نشاط يمكن اكتشافه في غضون 24 ساعة ، فمن المحتمل ألا يؤدي الإنزيم إلى تدهور الركيزة المختبرة. يعمل الإنزيم النشط على تحلل السكريات الكروموجينيكية غير القابلة للذوبان في ركيزة CPH إلى السكريات قليلة اللونين القابلة للذوبان ، والتي يمكن رؤيتها على أنها طافية ملونة.
- ضع لوحة المنتج النظيفة داخل مشعب التفريغ مع وجود كتلة فاصل بداخلها.
- ضع لوحة مجموعة الفحص في الأعلى وقم بتطبيق فراغ (أقصى ضغط سلبي -60 كيلو باسكال). من الممكن أيضا استخدام جهاز طرد مركزي عند 2,700 × جم لمدة 10 دقائق < br / >
ملاحظة: المرشح الذي يحتوي على السكريات قليلة السكاريد الملونة كمنتج التفاعل موجود الآن في لوحة المنتج لمزيد من التحليل.
< p class = "jove_title" >3. الكشف والقياس الكمي
- تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة المنتج هو نفسه تقريبا عن طريق الفحص البصري.
- اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 595 نانومتر ل CPH-xylan الأزرق باستخدام قارئ لوحة.
- عند إجراء تحليل البيانات ، اطرح قيم التحكم السلبية للمخزن المؤقت فقط من القيم من الآبار حيث تمت إضافة إنزيم. احسب متوسط القيمة والخطأ المعياري للوسائل (SEM) من الآبار المكررة.