فحص الإنزيم القائم على الكتلة الحيوية الكروموجينيك غير القابل للذوبان: اختبار لتقييم نشاط التحلل للإنزيمات المهينة للكتلة الحيوية النباتية

الملخص

المصدر: Schückel, J., et al. فحص عالي الإنتاجية للإنزيمات المهينة للكربوهيدرات باستخدام مجموعات فحص الركيزة الكروموجينيكية الجديدة غير القابلة للذوبان. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص الإنزيمات الفعالة في تحطيم السكريات المعقدة في الكتلة الحيوية النباتية باستخدام الكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان أو ICB. تقوم الإنزيمات بتحلل ICB لإطلاق السكريات قليلة السكاريد المرتبطة بالصبغة القابلة للذوبان ، ويتم تقييم نشاط الإنزيم عن طريق التحليل اللوني لمنتج التفاعل.

البروتوكول

فئة

1. فحص اللونان مع ركائز ICB بتنسيق 96 بئرا

1. تفاعل الإنزيم
   1. أضف 150 ميكرولتر 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولتر 31 وحدة / مل محلول endo-xylanase إلى كل بئر من لوحة مجموعة الفحص التي تحتوي على قش قمح ICB أحمر (تركيز الإنزيم النهائي في البئر: 1 وحدة / مل).
      ملاحظه: يتم تصنيع لوحات مجموعة الفحص (ألواح ترشيح 96 بئرا تحتوي على ركائز ICB) كما هو موضح في الأدبيات (انظر قائمة المواد). ركائز ICB مستقرة في المخازن المؤقتة مع نطاق الأس الهيدروجيني بين 3.0 إلى 10.0. قم دائما بتضمين المخزن المؤقت وحده كعنصر تحكم سلبي ، والإنزيمات التجارية كعنصر تحكم إيجابي واستخدم عددا مناسبا إحصائيا من النسخ المتماثلة.
      1. لا تقم بتنشيط ركائز ICB مثل لوحة الركيزة CPH ، ولكن قم بإزالة المثبت عن طريق الغسيل ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من الماء متبوعا بالترشيح الفراغي أو الطرد المركزي.
   2. ضع لوحة المنتج أسفل لوحة الركيزة لجمع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة أثناء الاهتزاز.
   3. احتضان التفاعل عند 25 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة
      ملاحظه: يعمل الإنزيم النشط على تحلل السكريات الكروموجينيكية غير القابلة للذوبان في ركيزة ICB إلى السكريات قليلة الذوبان ، والتي يمكن رؤيتها على أنها طافية ملونة. ركائز ICB مستقرة حتى 90 درجة مئوية. يجب زيادة وقت الحضانة حتى 24 ساعة إذا تم استخدام إنزيمات غير منقاة مثل مرق الاستزراع.
   4. ضع لوحة المنتج داخل مشعب التفريغ مع وجود كتلة فاصل بالداخل.
   5. ضع لوحة مجموعة الفحص في الأعلى وقم بتطبيق الفراغ (أقصى ضغط سلبي -60 كيلو باسكال) أو استخدم جهاز طرد مركزي لترشيح المنتج من لوحة مجموعة الفحص إلى بئر لوحة المنتج.
      ملاحظه: المرشح الذي يحتوي على السكريات قليلة السكاريد الملونة كمنتج تفاعل موجود الآن في لوحة التجميع لمزيد من التحليل.

< p class = "jove_title" >2. الكشف والقياس الكمي

1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة التجميع هو نفسه تقريبا عن طريق الفحص البصري.
2. اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 517 نانومتر لقش القمح ICB الأحمر باستخدام قارئ لوحة.
3. عند إجراء تحليل البيانات - طرح المخزن المؤقت - قيم التحكم السلبية فقط من القيم من الآبار حيث تمت إضافة الإنزيم. احسب القيمة المتوسطة والخطأ المعياري للوسائل (SEM) من الآبار المكررة.
   ملاحظه: في حالة فحص الإنزيمات غير المعروفة ، نقترح عمل سلسلة تخفيف من أجل الحصول على بيانات أكثر تفصيلا حول النطاق الديناميكي لنشاط الإنزيم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحات مجموعة الفحص جليكوسبوت لوحات طقم الفحص المخصصة 350 مل كتلة فاصل لوحة الاستقبال لمشعب الفراغ شركة بال 5015 كتلة فاصل لوحة مرشح HV متعددة الشاشات 96 بئر ، 0.45 ميكرومتر ، شفافة ، غير معقمة ميليبور MSHVN4510 لوحة الفحص 96 بئر ميكروبليت ، بولي بروبيلين غرينر بيو ون 651201 لوحة التجميع بعد غسل الركائز Nunc MicroWell 96-Well Microplates الترمو: العلمية هاتف: 269620 لوحة المنتج مضخة الحجاب الحاجز MZ 2 NT Vacuubrand 732000 مضخة فراغ تستخدم مع مشعب الفراغ إنفورز HT Ecotron إنفرز HT 4950132 (Buch & Holm) شاكر أفقي سبيكتراماكس M5 الأجهزة الجزيئية 10067-750 (VWR) قارئ امتصاص لوحة 96 جيدا مشعب الفراغ شركة بال 5017 مشعب الفراغ endo-β-1،4-xylanase M4 (الرشاشيات النيجر) ميجازيم E-XYAN4 زيلاناز [xyl]