مقايسة التلوين النووي التفاضلي: اختبار لتحديد السمية الخلوية للميتوكان عن طريق يوديد البروبيديوم والتلوين المزدوج Hoechst

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Pei ، J. et al. ، اختبار تلطيخ نووي تفاضلي آلي لتحديد دقيق للسمية الخلوية الميتوكانية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو طريقة تلطيخ نووي للكشف عن التأثير السام للخلايا للميتوكان على الخلايا السرطانية الحساسة للأدوية والمتغيرات الصحية. يوفر التلوين المزدوج بالأصباغ المرتبطة بالحمض النووي مثل يوديد البروبيديوم وصبغة Hoechst تمييزا واضحا بين الخلايا الميتة والخلايا الحية ، مما يساعد على تقييم السمية الخلوية للدواء.

البروتوكول

1. فحص السمية الخلوية: الإعداد

1. تحضير محاليل من المركبات ذات الأهمية بالتركيزات المرغوبة في الوسائط المناسبة (خالية من المصل أو 1 أو 2.5 أو 5٪ FBS RPMI-1640).
   1. لقياس السمية الخلوية لمركب واحد (على سبيل المثال ، لتحديد الجرعات الفعالة) ، قم بإعداد المركبات بتركيز نهائي 2x.
   2. لقياس السمية الخلوية لتركيبات المركبات ، قم بإعداد المركبات بتركيز نهائي 4x.
   3. قم بإعداد أدوات التحكم بالمذيبات فقط عن طريق خلط نفس الكمية من المذيبات مع الوسط المناسب. على سبيل المثال ، إذا تم اختبار المركبات الذائبة في DMSO والميثانول ، فقم بالتحكم بالمذيبات فقط لكل مذيب.
2. اجمع الخلايا من طبق المزرعة أو القارورة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
3. انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وصمة عار ب 10 ميكرولتر 0.4٪ تريبان بلو. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة لكل مصدر خلية.
4. خلايا الحبيبات في 200 جم لمدة 5 دقائق.
5. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط مناسبة للفحص (خالية من المصل أو 1 ، 2.5 ، 5٪ FBS RPMI-1640) بكثافة خلية 3 * 10⁵ خلايا / مل
   ملاحظة 1: توفر كثافة الخلية البالغة 3 * 10⁵ خلايا / مل كثافة بذر تبلغ 15,000 خلية / بئر. تعد كثافة البذر معلمة مهمة ويجب تحديدها مسبقا قبل التجربة. يجب أن تأخذ كثافة البذر في الاعتبار 1) حجم الخلية - عادة ما يتم زرع الخلايا الأكبر بكثافة أقل ؛ 2) مدة العلاج - عادة ما يتم زرع الخلايا بكثافة أقل للتجارب التي ستستمر لفترة أطول ، و 3) معدل انقسام الخلايا - يتم زرع الخلايا ذات معدل الانقسام الأعلى بكثافة أقل. أمثلة محددة لكثافة البذر المحسنة: خلايا K562 ، أكبر ، مدة 24 ساعة - 10,000 خلية / بئر ؛ خلايا MOLM-13 ، متوسطة الحجم ، علاج لمدة 24 ساعة - 15,000 / بئر ؛ خلايا MOLM-13 ، علاج لمدة 48 ساعة - 8,000 / بئر ؛ خلايا الدم المحيطية أحادية النواة الصغيرة السليمة (PBMCs), 24 ساعة العلاج – 50,000 / بئر; خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد الأولية, 24 ساعة العلاج – 15,000-20,000 / بئر.
   ملاحظة 2: قد يؤثر وجود FBS في وسائل الإعلام على نشاط المركبات. قد يؤدي تقليل تركيز FBS إلى تسهيل تفسير نتائج الفحص، ولكنه يقلل أيضا من الدقة الفسيولوجية.
6. قم بزرع 50 ميكرولتر من معلق الخلية من الخطوة 1.5 في كل بئر من صفيحة سعة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
7. أضف المركبات على النحو التالي:
   1. بالنسبة للمقايسات المركب الفردي ، أضف 50 ميكرولتر من محلول مركب 2x في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المذيبات ، أضف 50 ميكرولتر من وسائط الاختبار التي تحتوي على المذيب بتركيز 2x.
   2. بالنسبة للمقايسات المركبة، أضف 25 ميكرولتر من كل مركبة (4 أضعاف المحاليل) في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المركب الفردي ، أضف 25 ميكرولتر من محلول مركب 4x و 25 ميكرولتر من وسط الاختبار. بالنسبة لآبار التحكم في المذيبات ، أضف 50 ميكرولتر من وسط الاختبار أو وسط الاختبار الذي يحتوي على المذيب.
      ملاحظة 1: يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO 0.5٪ .
      ملاحظة 2: يوصى بإضافة الوسائط التي تحتوي على المركبات مع الماصة التي تلامس جدار كل بئر بسبب انخفاض حجمها.
8. اضغط برفق على اللوحة لضمان خلط محتويات الآبار.
9. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لفترة مناسبة ، على سبيل المثال ، 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. فحص السمية الخلوية: تلطيخ باستخدام Hoechst 33342 و Propidium Iodide

1. تحضير محلول تلطيخ 10x. يجب تحضير هذا المحلول طازجا قبل كل تجربة ، ولا يمكن تخزينه. يجب تحديد تركيزات الصبغة النهائية قبل التجربة.
   1. بالنسبة لخطوط خلايا ابيضاض الدم وخلايا ابيضاض الدم الأولية ، يحتوي 1 مل من محلول التلوين 10x على 10 ميكرولتر من 20 ملي مولار Hoechst 33342 و 50 ميكرولتر من 1 مجم / مل بروبيديوم يوديد في PBS المعقم (التركيزات النهائية: Hoechst 33342 20 ميكرومتر ، PI 5 ميكروغرام / مل).
   2. بالنسبة للثنائيات PBMCs الصحية ، يحتوي 1 مل من محلول التلوين 10x على 10 ميكرولتر من 20 ملي مولار Hoechst 33342 و 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل بروبيديوم يوديد في PBS المعقم (التركيزات النهائية: Hoechst 33342 20 μM ، PI 1 ميكروغرام / مل).
      ملاحظه: يجب تحديد التركيز النهائي ليوديد البروبيديوم قبل التجارب. يجب اختبار الخلايا باستخدام مجموعة من تركيزات PI (1 ، 2.5 ، 5 ميكروغرام / مل) ، ثم يجب مقارنة الجدوى المحسوبة بواسطة Hoechst / PI مع الجدوى المقاسة عبر التريبان الأزرق. تم اختيار تركيزات PI المذكورة أعلاه بناء على صلاحية الخلية المستهدفة في آبار التحكم في الوسائط (أعلى ~ 90٪ لخطوط خلايا سرطان الدم ، أعلى من ~ 70٪ ل PBMCs الصحية).
      أنذر: Hoechst 33342 و propidium iodide من المواد المسرطنة المحتملة. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل معها.
2. بعد الحضانة ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكرولتر من محلول تلطيخ 10x إلى كل بئر.
   ملاحظه: لمنع التلوث المتبادل، تأكد من أن أطراف الماصة لا تلمس الوسائط.
3. اضغط برفق على الطبق لخلط الفقاعات وإزالتها. وصمة عار عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. قم بالطرد المركزي للوحة على حرارة 200 جم لمدة 4 دقائق لإحضار جميع الخلايا إلى قاع اللوحة. امسح الجزء السفلي من اللوحة بعناية باستخدام kimwipe رطب لإزالة الألياف و / أو الحطام الذي يتداخل مع التصوير.
   ملاحظة 1: يضمن الطرد المركزي للوحة أعلى فرص لالتقاط جميع الخلايا في الصورة. غالبا ما تنفصل الخلايا الميتة وتطفو ، مما يوفر قيما مضللة للسمية الخلوية. الطرد المركزي يخفف من هذا التأثير.
   ملاحظة 2: يجب تصوير اللوحة في أسرع وقت ممكن بعد الطرد المركزي ، من الناحية المثالية ، في غضون 15 دقيقة. يمكن أن يقلل الطرد المركزي من انتقائية تلطيخ PI وقد يسمح للخلايا بتراكم يوديد البروبيديوم ببطء. التحسن في الدقة المكتسب من خلال تصور الخلايا الميتة يفوق الزيادة الطفيفة في تلطيخ PI

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-ديوكسي-د-جلوكوز / 2-DG كيمياء إمبكس 50-519-067 3-برومو بيروفات ألفا إيسار 1113-59-3 96-لوحات بئر غرينر بيو ون 655090 ألواح سوداء أو شفافة ذات قاع مسطح 96 بئر عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية ثيرمو فيشر قارئ التصوير متعدد الأوضاع Cytation 5 خلايا بيوتك هوشت: 33342 ثيرمو فيشر 62249 محلول 20 ملي ؛ التركيز النهائي 1: 1,000 HyClone مصل الأبقار الجنينية جنرال إلكتريك للرعاية الصحية # 25-514 م - كلوروفينيل هيدرازون / CCCP سيجما ألدريتش سي 2759 أقراص PBS ثيرمو فيشر BP2944100 1 قرص + 200 مل من الماء المعقم = 1x محلول PBS البنسلين والستربتومايسين والجلوتامين (100X) جيبكو 10378016 بروبيديوم يوديد ثيرمو فيشر 50-596-072 مسحوق جاف ؛ مخزون 1 مجم / مل في PBS ؛ التركيز النهائي 5 ميكروغرام / مل (خلايا سرطان الدم) ، 1 ميكروغرام / مل (PBMCs العادية) روتينون آرك فارم AK115691 RPMI-1640 متوسط مع L-الجلوتامين وبيكربونات الصوديوم ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلايا سيجما ألدريتش R8758-500 مل بقعة تريبان الزرقاء (0.4٪) جيبكو 15250-061 خطوط الخلايا ك 562 ATCC سي سي إل -243 خط خلايا CML مولم-13 ATCC خط خلايا AML مولت -4 ATCC رقم التعريف الهاتفي-1582 كل خط الخلايا OCI-AML2 ATCC خط خلايا AML