فحص انحلال الدم: طريقة في المختبر لقياس التحلل الناجم عن أيونات الكالسيوم في كريات الدم الحمراء البشرية

الملخص

المصدر: Bigdelou، P. et al.، تحريض الكريات في خلايا الدم الحمراء باستخدام أيونوفور الكالسيوم. J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو فحصا في المختبر لتحديد انحلال الدم الناجم عن أيونات الكالسيوم أو تحلل خلايا الدم الحمراء في عينة بشرية. يقيس الفحص النسبة المئوية لانحلال الدم عن طريق تحديد الهيموجلوبين المنبعث من كريات الدم الحمراء الممزقة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< ص الفئة = "jove_title">1. عزل كريات الدم الحمراء عن الدم الكامل

1. أضف 500 ميكرولتر من الدم الكامل في سكر العنب الحمضي (ACD) (المخزن عند 4 درجات مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   ملاحظه: تم شراء الدم الكامل في ACD. وفقا للشركة ، يضاف 1.5 مل من ACD إلى 7 مل من الدم الكامل (الحجم الكلي 8.5 مل).
قم
2. بالطرد المركزي للدم كله عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وقم بإزالة البلازما الصافية والطبقة الرقيقة باستخدام ماصة لترك طبقة كريات الدم الحمراء الحمراء.
3. تحضير 1 لتر من محلول Ringer يحتوي على 125 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي كلوريد الرأس ، و 1 ملي ملي مجم₄ ، و 32 ملي هيبس ، و 5 ملي مولار جلوكوز ، و 1 ملي كلوريد_{المكالسيوم 2}. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 بإضافة 2 ميكرولتر قطرات من 1.0 M هيدروكسيد الصوديوم. لتحضير محلول Ringer الخالي من الجلوكوز ، اتبع نفس البروتوكول ، لكن لا تقم بتضمين الجلوكوز في المحلول.
4. اغسل كريات الدم الحمراء 2x في محلول Ringer عن طريق تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من محلول Ringer ، والطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند RT ، وإزالة المادة الطافية.
5. اصنع 0.4٪ هيماتوكريت عن طريق تعليق 40 ميكرولتر من حبيبات كريات الدم الحمراء في 9,960 ميكرولتر من محلول Ringer الخالي من الجلوكوز للوصول إلى الحجم النهائي 10 مل><. ملاحظه: الهيماتوكريت هو مصطلح يستخدم للإشارة إلى الجزء الحجمي لكريات الدم الحمراء في التعليق. 0.4٪ هيماتوكريت هو معلق يحتوي على 0.4٪ كريات الدم الحمراء.
6. احتضان معلق الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.

< p class = "jove_title" >2. علاج كريات الدم الحمراء بالأيونومايسين وقياس انحلال الدم

1. قم بإذابة 1 مجم من ملح الكالسيوم الأيونومايسين في 630 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ملليمتر. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. خذ 1 مل من 0.4٪ هيماتوكريت من الخطوة 1.5 وأضف 0.5 ميكرولتر من 2 ملي مولار من الأيونومايسين للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر.
   1. استخدم 1 مل من الهيماتوكريت بدون علاج الأيونومايسين كعنصر تحكم سلبي.
قم
3. بالطرد المركزي للهيماتوكريات المعالجة بالأيونوميسين وغير المعالجة عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT وقم بإزالة المواد الطافية لترك كريات الخلية في قاع الأنابيب.
4. اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول Ringer عن طريق تعليق كريات الخلية في 1.5 مل من محلول Ringer ، والطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، والتخلص من المواد الطافية.
5. لقياس انحلال الدم ، أضف 1 مل من الهيماتوكريت 0.4٪ غير المعالج من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية كعنصر تحكم سلبي لانحلال الدم (0٪).
6. أضف 1 مل من الهيماتوكريت 0.4٪ غير المعالج من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وجهاز الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من الماء المقطر إلى حبيبات الخلية واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية كعنصر تحكم إيجابي لانحلال الدم (100٪).
7. أضف 1 مل من الهيماتوكريت المعالج بالأيونوميسين بنسبة 0.4٪ من الخطوة 2.2 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
8. الطرد المركزي للخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة والخلايا في الماء المقطر عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
9. خذ 200 ميكرولتر من المواد الطافية وأضفها إلى طبق مكون من 96 بئرا.
10. قم بقياس الامتصاص عند 541 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
11. احسب انحلال الدم باستخدام المعادلة 1:
    ٪ انحلال الدم = (A_T - A₀) / (A₁₀₀ - A₀) * 100
    حيث A₀ هو امتصاص كريات الدم الحمراء في محلول Ringer ، و_{A 100} هو امتصاص كريات الدم الحمراء في الماء ، و A_T هو امتصاص كريات الدم الحمراء المعالجة بواسطة الأيونومايسين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحة 96 بئر فيشر ساينتيك 12-565-331 CaCl2 فيشر ساينتيك سي 79-500 الطرد المركزي ميليبور سيجما م 7157 الموديل: Eppendorf 5415C DMSO سيجما ألدريتش 472301-100 مل مونوهيدرات الجلوكوز سيجما ألدريتش Y0001745 عازلة HEPES (1 م) فيشر ساينتيك 50-751-7290 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ملح الكالسيوم الأيونوميسين شركة EMD Milipore 407952-1 ملغ يذوب في DMSO ليصل إلى 2 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية كيه سي إل فيشر ساينتيك ص 330-500 MgSO4 فيشر ساينتيك M65-500 أنبوب الطرد المركزي الدقيق فيشر ساينتيك 02-681-5 كلوريد الصوديوم فيشر ساينتيك S271-500 قارئ الألواح الدقيقة HFM التآزر بيوتك دم كامل في ACD زين بيو يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ودافئ إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام