$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
1. مقايسة الربط في المرفق الخامس
- قم بإذابة 1 مجم من ملح الكالسيوم الأيونومايسين في 630 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ملليمتر. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- خذ 1 مل من 0.4٪ هيماتوكريت وأضف 0.5 ميكرولتر من 2 ملي مولار أيونومايسين للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر.
قم - بالطرد المركزي للهيماتوكريت المعالج بالأيونوميسين وغير المعالج عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وقم بإزالة المواد الطافية لترك كريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب.
- اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول Ringer عن طريق تعليق كريات الخلية في 1.5 مل من محلول Ringer ، والطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، والتخلص من المواد الطافية.
- أعد تعليق كريات خلايا كريات الدم الحمراء المعالجة بالأيونات وغير المعالجة في 1 مل من 1x مخزن مؤقت ملزم.
- قم بتخفيف 2 مل من المخزن المؤقت الملزم 5x Annexin V في 8 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على 1x مخزن مؤقت ملزم.
- خذ 235 ميكرولتر من معلقات الخلية في المخزن المؤقت الملزم وأضف 15 ميكرولتر من دقيق Annexin V-Alexa 488 المترافن.
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة في مكان مظلم. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وإزالة المادة الطافية.
- اغسل الخلايا 2x باستخدام مخزن مؤقت ملزم 1x ، عن طريق تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من المخزن المؤقت للربط ، والطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند RT ، وإزالة المادة الطافية.
- أعد تعليق كريات الخلية في 250 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت ربط لقياسات قياس التدفق الخلوي.
< p class = "jove_title" >2. قياس التدفق الخلوي
- نقل 200 ميكرولتر من كريات الدم الحمراء الملطخة بالملحق على شكل حرف V إلى 1 مل أنابيب البوليسترين القاع المستديرة المتوافقة مع قياس التدفق الخلوي.
- قم بتسجيل الدخول إلى برنامج قياس التدفق الخلوي وانقر على زر التجربة الجديدة. انقر فوق زر الأنبوب الجديد. حدد الورقة العالمية واختر تطبيق التحليل لقياس شدة التألق بطول موجي للإثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر.
- قم بتعيين عدد الخلايا إلى 20,000 ليتم جمعها لتحليل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).
- حدد الأنبوب المطلوب وانقر على زر التحميل. انقر فوق زر التسجيل لقياسات التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي. كرر لجميع العينات.
- انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر فوق تطبيق تحليل الدفعات لإنشاء ملف النتيجة.
- انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر فوق إنشاء ملفات FSC.