$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: كنقطة مرجعية ملائمة للقراء ، تصف المنهجية التالية ظروف الاستزراع والمواد المحددة المطلوبة لقياس التوافر البيولوجي للحديد من 20 عينة تجريبية ، بالإضافة إلى ضوابط الجودة المطلوبة ، في تشغيل المقايسة الحيوية. لا ينصح بزيادة عدد العينات بما يتجاوز هذه السعة بسبب الوقت اللازم لزراعة الخلايا المختلفة وخطوات الهضم في المختبر داخل المقايسة الحيوية.
< p class = "jove_title" >1. اختيار كمية العينات
- بالنسبة للأطعمة الصلبة أو السائلة ، حدد كمية الطعام التي يمكن اعتبارها ممثلة للعينة المراد اختبارها.
- في اختبار التوافر البيولوجي للحديد من مجموعة متنوعة من الفاصوليا ، استخدم 100-150 جم من بذور الفاصوليا وقم بمعالجة هذه الكمية إلى عينة متجانسة.
- بالنسبة للعينات السائلة مثل العصائر المدعمة ومنتجات الألبان والمشروبات الرياضية ، تأكد من خلط الطعام جيدا قبل أخذ العينات.
ملاحظة: كمية مادة بذور الفاصوليا المذكورة أعلاه ضرورية لحساب الاختلافات المتأصلة بين بذور هذا المحصول الأساسي.
< p class = "jove_title" >2. تحضير العينات
- اشطف التربة والغبار من أي عينة طعام بالماء المقطر منزوع الأيونات قبل المعالجة.
- قم بمعالجة الكمية المناسبة من العينة وفقا للأهداف التجريبية ، مثل طريقة الطهي والطحن.
ملاحظة: للطهي والمعالجة ، من الأهمية بمكان استخدام أواني الطهي والمعدات التي ليست مصدرا محتملا للتلوث الحديد. معدات الفولاذ المقاوم للصدأ لا تلوث. ومع ذلك ، فإن المعدات مثل مطاحن مطحنة الحجر ، وتجهيزات المطابخ المصنوعة من الحديد الزهر ، وأي معدات غير مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ تحتوي على الحديد يمكن أن تضيف كميات كبيرة من الحديد الملوث. غالبا ما تكون مطحنة القهوة القياسية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ مناسبة للطحن.
- تجميد الطحن وطحنها إلى مسحوق متجانس.
ملاحظة: بمجرد تجانسها ، أظهرت الأبحاث أن ثلاث نسخ مكررة مستقلة من التحليل كافية لكل طعام يتم قياسه.
- إذا كان من الصعب تحقيق تجانس العينة ، فقم بمراجعة صياغة المنتج أو معالجته. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فقم بإضافة التكرارات إذا لم يكن عدم التجانس شديدا.
- بالنسبة لمعظم الأطعمة الصلبة المتجانسة ، استخدم 0.5 جم من العينة المجففة بالتجميد لكل تكرار. إذا لزم الأمر ، استخدم ما يصل إلى 1.0 جم من العينة لكل تكرار ، ولكن تحقق مما إذا كان أكثر من 0.5 جم ينتج عنه فائدة في درجة الاستجابة.
ملاحظة: قد تسد الكميات التي تزيد عن 0.5 جرام من الأطعمة الصلبة غشاء غسيل الكلى (انظر أدناه).
- استخدم 1-2 مل من العينات السائلة.
ملاحظه: غالبا ما لا يكون التجميد ضروريا للعينات السائلة.
فئة
3. ثقافة خلايا Caco-2
- ثقافات الأسهم
- الحصول على خلايا Caco-2 من مورد معتمد.
- استزراع الخلايا من قوارير المخزون عند 37 درجة مئوية في حاضنة ذات جو هواء 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (رطوبة ثابتة) باستخدام Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مكمل ب 25 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 7.2) ، و 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1٪ محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات.
- بمجرد توفر خلايا كافية ، عادة بعد 7-10 أيام من الثقافة ، قم بزرع الخلايا في قوارير غير مغلفة بالكولاجين بكثافة 30,000 خلية / سم2.
- اختر حجم القارورة اعتمادا على عدد الخلايا المتاحة واللازمة لبذر الألواح متعددة الآبار.
ملاحظة: بشكل عام ، تعمل قوارير T225 (225 سم2) بشكل أفضل للتجارب حيث يتم استخدام 11 لوحا متعدد الآبار (6 آبار ؛ 9.66 سم2 / بئر) (10 لوحات لمقارنات العينات ، لوحة واحدة لمراقبة الجودة) لكل اختبار حيوي.
- قم بزراعة الخلايا في قوارير لمدة 7 أيام ، وقم بتغيير الوسط كل يومين ، واستخدمها في اليوم السابع لبذر الألواح متعددة الآبار.
ملاحظة: يوصى باستخدام نطاق مرور لا يزيد عن 10-15 مقطعا من وقت بدء الخلايا من زراعة المخزون واستخدامها لاحقا في سلسلة من التجارب. يجب أن تكون ممرات زراعة الخلايا محدودة لأن مجموعة واسعة من الممرات يمكن أن تؤدي إلى تغييرات تكيفية في خط الخلية ، وبالتالي التباين في استجابة النموذج.
- زراعة الخلايا على ألواح متعددة الآبار
- زرع خلايا Caco-2 بكثافة 50,000 خلية / سم2 في ألواح مطلية بالكولاجين مكونة من 6 آبار.
ملاحظة: عادة ما تعمل هذه الخطوة بشكل أفضل إذا تم إجراؤها يوم الأربعاء. ستوضح الخطوات التالية سبب كون هذا اليوم من أيام الأسبوع هو الأمثل.
- قم بزراعة الخلايا لمدة 12 يوما عند 37 درجة مئوية في حاضنة ذات جو هواء 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (رطوبة ثابتة) باستخدام DMEM مكمل ب 25 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 7.2) و 10٪ (حجم / حجم) FBS و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي زراعة الطبقات الأحادية للخلية لمدة تزيد عن 12 يوما إلى فرط نمو الخلايا. أظهرت الأبحاث السابقة بوضوح أنه في ظل هذه الظروف ، بعد 12 يوما من البذر ، تكون الطبقة الأحادية للخلية ناضجة ، ومتصلة جيدا باللوحة ، ومثالية في اتساق الاستجابة. تؤدي زراعة الخلايا لفترة أطول ، مثل ما يصل إلى 19-21 يوما ، إلى فرط نمو الخلايا ، وتستنفد الوسائط بسرعة من العناصر الغذائية ، مما يؤدي إلى طبقات أحادية غير صحية.
- خلال فترة ال 12 يوما ، قم بتغيير الوسيط كل يومين على الأقل وفقا لجدول يومي ثابت.
- في اليوم الثاني عشر بعد البذر ، استبدل وسط الاستزراع ب 2 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM [pH 7]) مكمل بأنابيب 10 ملي مولار (بيبيرازين-N ، N'-bis- [2-حمض إيثان سلفونيك]) ، محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات بنسبة 1٪ ، هيدروكورتيزون (4 مجم / لتر) ، الأنسولين (5 مجم / لتر) ، السيلينيوم (5 ميكروغرام / لتر) ، ثلاثي يودوثيرونين (34 ميكروغرام / لتر) ، وعامل نمو البشرة (20 ميكروغرام / لتر).
ملاحظة: إذا بدأ البذر يوم الأربعاء ، فسيكون اليوم الثاني عشر يوم الاثنين.
- في اليوم التالي (أي اليوم 13) ، قم بإزالة MEM واستبدله ب 1 مل من MEM (الرقم الهيدروجيني 7).
ملاحظة: ستحدث هذه الخطوة يوم الثلاثاء. هذا هو اليوم الذي يبدأ فيه الاختبار الحيوي. وبالتالي ، فإن الجدول الزمني لمدة 13 يوما ينتج عنه ميزة جدول أسبوعي ثابت ، مما يسمح بإجراء الاختبار الحيوي باستمرار في نفس يوم الأسبوع.
< ص الفئة = "jove_title">4.
الهضم في المختبر
- تحضير حلقات الإدراج
- قم بإنشاء حلقة إدخال معقمة باستخدام حلقة سيليكون O مزودة بغشاء غسيل الكلى المغسول بالحمض (الشكل 1 أ).
ملاحظة: قم بإعداد الإدخالات قبل يوم واحد (أي الاثنين ، اليوم 12) من يوم الاختبار الحيوي وتخزينها في 18 MΩ ماء عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
- في يوم الاختبار الحيوي (الثلاثاء ، اليوم 13) ، قم بإزالة الإدخالات من الثلاجة ، وصفيها ، واستبدل الماء ب 0.5 M HCl. اتركه في درجة حرارة الغرفة في غطاء التدفق الصفحي لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة قبل إزالة MEM من لوحات الاستزراع. يعمل الغسيل الحمضي للغشاء على إزالة الحديد الملوثة المحتملة وتعقيم حلقة الإدخال والغشاء.
- صفي 0.5 M HCl من الحشوات واشطفها بماء معقم 18 MΩ. يحفظ في ماء معقم 18 MΩ في درجة حرارة الغرفة في شفاط تدفق رقائقي حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
- أدخل حلقة في كل بئر من الألواح المكونة من 6 آبار مع خلايا Caco-2 ، وبالتالي إنشاء نظام من غرفتين. أعد الألواح مع الإدخالات إلى الحاضنة.
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة مباشرة بعد إضافة 1.0 مل من MEM الطازج إلى كل بئر (انظر الخطوة 3.2.5).
- تحضير محلول البيبسين
- في يوم التجربة ، قم بإعداد محلول البيبسين عن طريق إذابة 0.145 جم من البيبسين في 50 مل من 0.1 مل حمض الهيدروكلوريك. رج المحلول برفق على شاكر المنصة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير محلول البنكرياتين الصفراوي
- في نفس يوم التجربة ، قم بإعداد 0.1 M NaHCO3 عن طريق إذابة 2.1 جم من NaHCO3 في 250 مل من 18 MΩ ماء.
- امزج 0.35 جم من البنكرياتين و 2.1 جم من مستخلص الصفراء في 175 مل من 0.1 M NaHCO3.
- بمجرد إذابة مستخلص البنكرياتين والصفراء ، أضف 87.5 جم من راتنج التبادل الكاتيوني الضعيف (انظر جدول المواد) واخلطه عن طريق الرج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- صب الملاط في عمود كبير وجمع التميء.
- قم بإزالة العمود ب 70 مل إضافي من 0.1 M NaHCO3 ، وجمع هذا الحجم في محلول البنكرياتين الصفراوي.
ملاحظة: الغرض من الراتنج هو إزالة الملوثات الحديدية الموجودة بشكل شائع في مستخلصات البنكرياتين والصفراء.
- بدء الهضم في المختبر.
- قم بوزن العينة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل (بولي بروبيلين) ، متبوعا بإضافة 10 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي عند درجة الحموضة 2 ، يحتوي على 140 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي كلوريد الصوديوم.
- ابدأ عملية هضم المعدة بإضافة 0.5 مل من محلول البيبسين الخنازير المحضر إلى العينة واحتضانه على شاكر هزاز عند إعداد منخفض ولطيف لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
- بعد هذه الفترة ، ابدأ عملية الهضم المعوي لكل عينة عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5-6.0 مع 1.0 M NaHCO3.
- أضف 2.5 مل من محلول البنكرياتين الصفراوي إلى كل أنبوب عينة واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.9-7.0 مع 1.0 M NaHCO3.
- بمجرد ضبط الرقم الهيدروجيني ، قم بمعادلة الحجم في كل أنبوب باستخدام محلول 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار KCl (الرقم الهيدروجيني 6.7) ، وقياس وزن الأنبوب بقيمة مستهدفة تبلغ 15 جم
ملاحظة: بالنسبة لبعض الأطعمة ، قد يحتاج المرء إلى رفع الحجم الإجمالي إلى 16 جم أو 17 جراما ، اعتمادا على قدرة التخزين المؤقت للأطعمة.
- انقل 1.5 مل من كل هضم معوي إلى الغرفة العلوية (أي تحتوي على حلقة الإدخال مع غشاء غسيل الكلى) من بئر مقابل للوحة الثقافة المكونة من 6 آبار تحتوي على خلايا Caco-2 (الشكل 1 ب).
- استبدل غطاء اللوحة واحتضنه عند 37 درجة مئوية (5٪ جو هواء ثاني أكسيد الكربون2) على شاكر هزاز عند 6 تذبذبات / دقيقة لمدة ساعتين.
- قم بإزالة حلقة الإدخال مع الملخص وأضف 1 مل إضافي من MEM (درجة الحموضة 7) إلى كل بئر.
- أعد لوحة زراعة الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ جو هواء ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 22 ساعة إضافية.
- بعد 22 ساعة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلية وأضف 2.0 مل من 18 MΩ ماء إلى طبقة الخلية أحادية.
ملاحظة: سوف يقوم الماء بتحليل الخلايا بشكل تناضحي.
- حصاد محللة الخلية بأكملها في أنابيب طرد مركزي قياسية من مادة البولي بروبيلين أو ما شابه ذلك لتحليلات بروتين الخلية اللاحقة وتحليلات الفيريتين الخلية.
