مقالة منهجية

مقايسة استنفاد الجلوكوز في المختبر: طريقة قائمة على التألق لتحديد كمية امتصاص الجلوكوز الخلوي عن طريق قياس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kumar ، S. B. et al. ، استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي.J. Vis. Exp.(2022)

يوضح هذا الفيديو مقايسة في المختبر لقياس امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا بشكل غير مباشر. يستخدم الاختبار نظيرا للجلوكوز المسمى بالفلورسنت لإنشاء علاقة بين استنفاد الجلوكوز خارج الخلية وامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية مع تشغيل المنفاخ وإطفاء الأضواء.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

ملاحظة: جميع المواد مدرجة في جدول المواد.

  1. قم بإعداد المتوسط 1 ، ووسط الطرد المركزي 2 ، ومحاليل التخزين والعمل من الفلورسنت 2-deoxy-2- [(7-nitro-2،1،3-benzoxadiazol-4-yl) amino] -D-glucose (2-NBDG أو FD-glucose) وفقا للجدول 1 في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية. قم بحماية FD-glucose من الضوء طوال التجربة عن طريق إطفاء جميع الأضواء الموجودة أسفل الغطاء.
  2. استخدم كواشف زراعة الخلايا الجاهزة للاستخدام: Trypsin-EDTA ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ووسط النسر المعدل الخالي من الجلوكوز والفينول (المشار إليه فيما يلي ، DMEM الخالي من الجلوكوز).
  3. استخدم 20 مل من المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي المشع (RIPA).
    ملاحظة: في الأقسام التالية ، تتم مقارنة الاستنفاد خارج الخلية والامتصاص داخل الخلايا لجرعات مختلفة من الجلوكوز FD في الخلايا الليفية 3T3-L1 مع وبدون تحفيز الأنسولين (الشكل 1).
< p class = "jove_title" >2. 3T3-L1 زراعة الخلايا وصيانتها

  1. استزراع الخلايا الليفية للفأر 3T3-L1 عن طريق طلاء 1 × 106 خلايا مخففة في 20 مل من Medium 1 في لوحين 96 بئرا. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر ، مما يضمن الحفاظ على تجانس هذا المعلق عن طريق الخلط. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ رطوبة) دون تغيير الوسائط حتى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
  2. حافظ على الخلايا ملتقية وصيامها عن طريق زراعتها في نفس الوسط لمدة 48 ساعة. قم بتغيير وقت الحضانة من 24-72 ساعة حسب حالة الصيام التقويضي المرغوبة.
فئة

3. تجويع خلايا 3T3-L1

  1. صب الوسائط من الخلايا في الألواح المكونة من 96 بئرا. امتصاص السوائل المتبقية باستخدام مناشف ورقية معقمة.
  2. اشطف الطبق المكون من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر وامتص السوائل المتبقية باستخدام مناشف ورقية معقمة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز لكل بئر واحتضنه لمدة 40 دقيقة. اضبط وقت الحضانة اعتمادا على نوع الخلية والمحفزات ومستوى الصيام المطلوب.
    ملاحظة: قد يتطلب وقت الحضانة التحسين حسب الموسم.
< p class = "jove_title" >4. تحضير محاليل FD-glucose بتركيزات مختلفة

ملاحظة: تفحص التجربة في الشكل 1 الوسائط خارج الخلية وبين الخلايا مع وبدون تحفيز بالأنسولين.

  1. استخدم ثمانية مكررات (صف واحد في لوحة 96 بئرا) لكل حالة تحفيز. لذلك ، قم بإعداد 1 مل لكل حالة تحفيز (محددة في الجدول 2 وأدناه).
  2. استخدم ثمانية ظروف تحفيز بدون الأنسولين: FD-glucose بمقدار 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في طبق واحد 96 بئر.
  3. استخدم ثمانية شروط تحفيز مع الأنسولين (10 ميكروغرام / مل ، التركيز النهائي): FD-glucose 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في طبق آخر 96 بئر.
  4. لتحضير ظروف التحفيز ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose 5 مجم / مل (الجدول 1) في 999 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز للحصول على 1 مل من محلول مخزون العمل (1: 1000 تخفيف أو 5 ميكروغرام / مل).
    1. باستخدام محلول مخزون العمل هذا ، قم بإعداد 1: 2000 ، 1: 5000 ، 1: 10،000 ، 1: 25،000 ، 1: 50،000 ، و 1: 100،000 من FD-glucose للحصول على 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، و 0.05 ميكروغرام / مل (الجدول 2) في أنابيب 2 مل مباشرة قبل التجارب في خزانة السلامة الحيوية بدون أضواء.
  5. كرر الخطوة 4.4 وأضف 1 ميكرولتر من الأنسولين (10 مجم / مل ، التركيز النهائي) لكل حالة من الشروط المحددة أعلاه><. ملاحظة: التركيز النهائي للأنسولين في هذه العينات هو 10 ميكروغرام / مل = 1.7 نانومول / مل. لتحقيق التجانس ، أضف الأنسولين إلى الأنابيب قبل إضافة محاليل أخرى.
< p class = "jove_title" >5. علاج خلايا 3T3-L1 الجائعة

  1. بعد 40 دقيقة من الحضانة ، قم بصب DMEM الخالي من الجلوكوز من كل بئر في 96 بئرا وامتصاص السائل المتبقي باستخدام مناشف ورقية معقمة.
  2. أضف 100 ميكرولتر (لكل بئر) لكل من ظروف المعالجة المختلفة الموضحة أعلاه إلى الآبار على طول عمود واحد ، و 100 ميكرولتر (لكل بئر) من نفس حالة المعالجة إلى الآبار على طول الصف (ثمانية مكررات) في كلتا الألواح المكونة من 96 بئرا. قم بتسمية اللوحات التي استخدمت الظروف مع الأنسولين وبدونه. أضف DMEM الخالي من الجلوكوز وحده إلى آبار التحكم (ن = 8).
  3. احتضان اللوحة لمدة 40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 95٪ رطوبة) في الظلام.
< p class = "jove_title" >6. القياسات خارج الخلايا وبين الخلايا لخلايا 3T3-L1 المحفزة

  1. بعد تحفيز الخلايا لمدة 40 دقيقة ، انقل وسائط التحفيز من كلتا اللوحتين إلى ألواح جديدة مكونة من 96 بئرا تحافظ على نفس التصميم التجريبي.
  2. صب أي محلول متبقي من الألواح الأصلية المحفزة المكونة من 96 بئرا بخلايا على مناشف ورقية معقمة.
  3. اختياريا ، اغسل الخلايا باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وصب أي محلول متبقي على مناشف ورقية معقمة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RIPA إلى كل بئر. اختياريا ، أضف مثبطات الإنزيم البروتيني إلى المخزن المؤقت RIPA لحماية البروتينات. ضع الأطباق التي تحتوي على RIPA في شاكر لمدة 30 دقيقة.
  5. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة (جدول المواد) ، قم بقياس الأطوال الموجية الفلورية عند الإثارة (Ex) والانبعاث (Em) البالغة 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، أولا في الوسط الذي يحتوي على FD-glucose خارج الخلية ، ثم اللوحة التي تحتوي على خلايا RIPA المحللة في نهاية 30 دقيقة من الحضانة (انظر الخطوة 6.4).

الجدول 1: تحضير وسائط الاستزراع ومحاليل FD-glucose.

الحل / متوسط مكونات الإيثانول: DMSO (1: 1 / حجم / حجم) الإيثانول (200 ميكرولتر) و DMSO (200 ميكرولتر) في أنبوب 1-1.5 مل ؛ استخدم الإيثانول بدرجة زراعة الخلايا و DMSO متوسط 1 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) ومصل العجل (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم سعة 50 مل الطرد المركزي متوسط 2 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) ومصل البقر (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم سعة 50 مل تخزين محلول FD-glucose 5 مجم / مل (14.5 مل) FD الجلوكوز (1 مجم) والإيثانول: DMSO (1: 1 / v / v) (200 ميكرولتر) في أنبوب 0.5 مل ؛ يحفظ عند -80 درجة مئوية ، ويفضل تحت جو الأرجون أو النيتروجين محلول FD-glucose العامل 5 ميكروغرام / مل (14.5 مل) تخزين محلول الجلوكوز FD 5 مجم / مل (1 ميكرولتر) ، DMEM خال من الجلوكوز (999 ميكرولتر) ؛ تحضير مباشرة قبل التجربة. < p class = "jove_content" >الجدول 2: تحضير محاليل FD-glucose بتركيزات مختلفة للتجارب الموضحة في الشكل 1.

التخفيف تحكم 1:2x103 1:5x103 1: 1 × 104 1: 2.5 × 104 1:5 × 104 1: 1 × 105 التركيز (ميكروغرام / مل) 0 2.5 1 0.5 0.2 0.1 0.05 DMEM خال من الجلوكوز (ميكرولتر) 1000 500 جنيه 800 دولار 900 ريال 960 980 990 FD الجلوكوز 5 ميكروغرام / مل (ميكرولتر) 0 500 جنيه 200 ريال 100 40 20 10

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: استنفاد جلوكوز FD خارج الخلية المرتبط بالامتصاص داخل الخلايا في المختبر.تم تحضين الخلايا الشحمية 3T3-L1 في وسط خال من الجلوكوز لمدة 40 دقيقة قبل الحضانة بتركيزات مختلفة من FD-glucose مع وبدون الأنسولين (1.7 ملي مولار ؛ 40 دقيقة حضانة). (أ ، ب) امتصاص FD-glucose (A) واستنفاد FD-glucose خارج الخلية (B) المعتمد على الجرعة (أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 3T3-L1 الخلايا الليفية للفأر ATCC CL-173 خط الخلية 96 أطباق بئر صقر 353227 أدوات بلاستيكية قارئ الألواح الدقيقة المعياري متعدد الأوضاع BioTek Synergy H1 (فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة) فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة ب - SHT جهاز مصل الأبقار جيبكو / ثيرموفيشر 161790-060 زراعة الخلايا مصل ربلة الساق جيبكو / ثيرموفيشر هاتف: 26010-066 زراعة الخلايا حاضنة الخلية فورما سترة مائية من السلسلة الثانية جهاز ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما لايف ساينس D2650-100 مل الكاشف وسط النسر المعدل من Dulbecco جيبكو / ثيرموفيشر 11965-092 زراعة الخلايا ايثانول سيجما ألدريتش E7023-500 مل الكاشف الفلورسنت 2-ديوكسي-2- [(7-نيترو-2،1،3-بنزوكساديازول-4-يل) أمينو]-د-جلوكوز) سيغما 72987-1 ملغ تحليل DMEM خال من الجلوكوز وخالي من الفينول الأحمر جيبكو / ثيرموفيشر أ14430-01 زراعة الخلايا الأنسولين البشري 10 مجم / مل MilliporeSigma كات N 91077C الكاشف البنسلين / الستربتومايسين (P / S) جيبكو / ثيرموفيشر 15140-122 زراعة الخلايا محلول مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش DA537-500 مل زراعة الخلايا المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-24948 تحليل التربسين EDTA (0.05٪) جيبكو / ثيرموفيشر هاتف: 25300-054 زراعة الخلايا

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة