قياس الاستنفاد التناظري للجلوكوز الفلوري خارج الخلية: تقنية قياس بديلة لتقييم امتصاص الجلوكوز في أعضاء الفئران خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Kumar ، S. B. et al. ، استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي.J. Vis. Exp.(2022)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية ex vivo لقياس استنفاد الجلوكوز التناظري خارج الخلية في أعضاء الفئران المحصودة. يتضمن احتضان أنسجة الفأر في محلول يحتوي على ديوكسي جلوكوز المسمى بالفلورسنت ، والذي تمتصه الخلايا. يمكن تحديد امتصاص الجلوكوز التناظري بشكل غير مباشر عن طريق قياس مضان الوسط المحتضن.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية مع تشغيل المنفاخ وإطفاء الأضواء.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

ملاحظة: جميع المواد مدرجة في جدول المواد.

1. قم بإعداد المتوسط 1 ، ووسط الطرد المركزي 2 ، ومحاليل التخزين والعمل من الفلورسنت 2-deoxy-2- [(7-nitro-2،1،3-benzoxadiazol-4-yl) amino] -D-glucose (2-NBDG أو FD-glucose) وفقا للجدول 1 في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية. قم بحماية FD-glucose من الضوء طوال التجربة عن طريق إطفاء جميع الأضواء الموجودة أسفل الغطاء.
2. استخدم كواشف زراعة الخلايا الجاهزة للاستخدام: Trypsin-EDTA ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، ووسط النسر المعدل الخالي من الجلوكوز والفينول (المشار إليه فيما يلي ، DMEM الخالي من الجلوكوز).

< p class = "jove_title" >2. قياس خارج الجسم الحي لاستنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في الأعضاء

1. قم بمعالجة الفئران بمركبات تحفز استقلاب الجلوكوز قبل تشريح الأعضاء ، على النحو التالي.
2. استخدم ذكور Lep^ob البالغة من العمر تسعة أسابيع (ن = 11). أطعم جميع الفئران بنظام غذائي منتظم قبل التجربة.
3. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات للحقن داخل الصفاق (IP).
   1. حقن الفئران من مجموعة التحكم Lep^ob مع 0.1 مل من PBS المعقم (ن = 4).
   2. حقن الفئران من مجموعة الأنسولين Lep^ob مع 0.1 مل من PBS المعقم ، الذي يحتوي على 12 وحدة دولية من الأنسولين البشري لكل جرام من وزن الجسم (BW) (ن = 3).
   3. حقن الفئران من مجموعة AAC2 Lep^ob ب 0.1 مل من PBS المعقم ، الذي يحتوي على 0.1 نانومول AAC2 لكل جرام من وزن الجسم (BW) (ن = 4).
4. بعد 15 دقيقة ، قم بتعريض الفئران لاستنشاق 5٪ من الأيزوفلوران وإخراج الدم عن طريق ثقب القلب من المخدرة.
5. تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية الحشوية (200 مجم) والكبد (200 مجم) والدماغ كله من كل. استخدم شفاط السلامة الحيوية من الفئة الثانية لمناولة الأنسجة.
6. قم بإعداد محلول عمل FD-glucose (0.29 ملم) في DMEM الخالي من الجلوكوز في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية بدون ضوء.
7. قم بقياس تألق محلول عمل FD-glucose (0.29 mM) عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
8. احتضان الأنسجة / الأعضاء المحصودة في صفيحة من 6 آبار تحتوي على PBS لمدة 1 دقيقة.
9. بعد 1 دقيقة ، ضع كل منديل على منشفة ورقية معقمة لامتصاص PBS. نقل الأنسجة / الأعضاء إلى صفيحة منفصلة مكونة من 6 آبار تحتوي على 4,000 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز واحتضانها لمدة دقيقتين.
10. بعد دقيقتين ، قم بإزالة الأنسجة ونقلها إلى آبار من صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على 0.29 ملي مولار FD-glucose محلول عمل (1 مل / بئر). احتضان الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على أنسجة في محلول عمل FD-glucose عند 37 درجة مئوية (5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة).
11. اجمع 100 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose من كل بئر بعد 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة من الحضانة ، لتحليل حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية. رج العبوة قبل الجمع وبعده.
12. انقل 100 ميكرولتر من محلول عمل الجلوكوز FD إلى ألواح ذات 96 بئرا لقياس التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
13. تطبيع التألق إلى قيمة 0 دقيقة (100٪) لكل عضو في كل (الشكل 1).

الجدول 1: تحضير وسائط الاستزراع ومحاليل FD-glucose.

الحل / متوسط مكونات الإيثانول: DMSO (1: 1 / حجم / حجم) الإيثانول (200 ميكرولتر) و DMSO (200 ميكرولتر) في أنبوب 1-1.5 مل ؛ استخدم الإيثانول بدرجة زراعة الخلايا و DMSO متوسط 1 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) ومصل العجل (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم سعة 50 مل الطرد المركزي متوسط 2 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) ومصل البقر (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم سعة 50 مل تخزين محلول FD-glucose 5 مجم / مل (14.5 مل) FD الجلوكوز (1 مجم) والإيثانول: DMSO (1: 1 / v / v) (200 ميكرولتر) في أنبوب 0.5 مل ؛ يحفظ عند -80 درجة مئوية ، ويفضل تحت جو الأرجون أو النيتروجين محلول FD-glucose العامل 5 ميكروغرام / مل (14.5 مل) تخزين محلول الجلوكوز FD 5 مجم / مل (1 ميكرولتر) ، DMEM خال من الجلوكوز (999 ميكرولتر) ؛ تحضير مباشرة قبل التجربة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في أعضاء مختلفة من الجسم الحي. (AC) تم حقن الفئران Lep^ob بالمركبة (PBS ، ن = 4) ، الأنسولين (12 وحدة دولية / كجم من وزن الجسم ، ن = 3) ، و AAC2 (1 نانومول / جم BW ، ن = 3). بعد 15 دقيقة ، تم تشريح الأنسجة وعزلها. تم تحضين مستخلصات الدهون الحشوية (أ) والكبد و (

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 أطباق بئر صقر 353227 أدوات بلاستيكية ب 6. V-Lepob / J ذكور الفئران مختبر جاكسون رقم المخزون 000632 فئران قارئ الألواح الدقيقة المعياري متعدد الأوضاع BioTek Synergy H1 (فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة) فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة جهاز حاضنة الخلية فورما سترة مائية من السلسلة الثانية جهاز النظام الغذائي (حمية الفئران / الفئران ، مشععة) إنفيجو تيكلاد LM-485 النظام الغذائي إيزوفلوران ، 5٪ هنري شاين NDC 11695-6776-2 مخدر محلول مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش DA537-500 مل زراعة الخلايا البنسلين / الستربتومايسين (P / S) جيبكو / ثيرموفيشر 15140-122 زراعة الخلايا DMEM خال من الجلوكوز وخالي من الفينول الأحمر جيبكو / ثيرموفيشر أ14430-01 زراعة الخلايا الفلورسنت 2-ديوكسي-2- [(7-نيترو-2،1،3- بنزوكساديازول-4-يل) أمينو]-Dglucose) سيغما 72987-1 ملغ تحليل وسط النسر المعدل من Dulbecco جيبكو / ثيرموفيشر 11965-092 زراعة الخلايا مصل الأبقار جيبكو / ثيرموفيشر 161790-060 زراعة الخلايا ايثانول سيجما ألدريتش E7023-500 مل الكاشف