$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرعاية الإنسان وتم مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلية
< p class = "jove_title" >1. قياس الانكماش (مثال SMCs)
- قم بإعداد مصفوفة 96w10e ECIS (انظر الشكل 1 أ للحصول على صورة تمثيلية للمصفوفة مع أقطاب كهربائية مكبرة وخلايا مصنفة على الأقطاب الكهربائية).
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية تحت غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة المعقمة.
- قم بتغطية مجموعة معقمة 96w10e ب 200 ميكرولتر من 10 ملي مولار L-cysteine لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الطبق مرتين بالماء المعقم. اترك الطبق يجف طوال الليل في غطاء مزرعة الأنسجة مع فتح الغطاء قليلا.
ملاحظة: طلاء اللوحة ب L-cysteine ضروري فقط عند استخدام اللوحة لأول مرة.
- في اليوم التالي ، قم بتعقيم اللوحة والغطاء بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. اقلب الغطاء لأعلى بحيث يتم تعقيم الداخل. بمجرد تعقيم اللوحة ، لا تفتح اللوحة خارج غطاء التدفق.
- خلايا البذر على مصفوفة ECIS
- قم بتسخين محلول الجيلاتين المعقم بنسبة 1٪ في الحمام المائي لمدة 30 دقيقة < / >
ملاحظة: يتم تخزين المحلول في الثلاجة وقد يتجمد ، مما يجعل من الصعب ماصته.
- بعد ذلك ، قم بتغطية الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين بنسبة 1٪ لكل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- استنشق الجيلاتين من الآبار.
- عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وقم بزرع SMCs ثلاث نسخ بكثافة بذر تبلغ 30,000 خلية / بئر في 200 ميكرولتر من وسط SMC.
- ضع اللوحة مع SMCs في حامل ECIS 96-well في حاضنة زراعة الخلايا. انقر نقرا مزدوجا فوق برنامج ECIS Applied Biophysics لفتح البرنامج واضغط على زر الإعداد.
- تحقق مما إذا كانت جميع الأقطاب الكهربائية ملامسة للحامل (أخضر ؛ أحمر إذا لم يكن هناك اتصال) في اللوحة السفلية اليسرى المسماة تكوين البئر. إذا لم يتم توصيل الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح ، فاضبط اللوحة في الحامل قبل بدء القياس.
- حدد نوع اللوحة (مصفوفة 96 بئر) في نفس اللوحة بالنقر فوق نوع المصفوفة.
- في اللوحة العلوية اليمنى إعداد جمع البيانات، انقر فوق تردد واحد وقم بتغيير قيمة المعاوقة إلى 4000 هرتز والفاصل الزمني إلى 8 ثوان.
- انقر فوق الزر "ابدأ" لبدء القياسات. انتظر حتى يتم فتح لوحة جديدة، حيث يمكن حفظ ملف ECIS.
- اسمح للخلايا بالالتصاق وإنشاء طبقة أحادية لمدة 48 ساعة
ملاحظة: يولد ربط الخلايا وانتشارها على الأقطاب الكهربائية قيمة مقاومة أساسية (الشكل 1 ب).
- تحفيز الخلايا للحث على الانقباض
- تحفيز تقلص SMC عن طريق تحفيز الخلايا ب 10 ميكروغرام / مل من أيونوفور الكالسيوم ، الأيونومايسين
ملاحظة: سوف يحفز الأيونومايسين تدفق الكالسيوم خارج الخلية2+ ، مما يؤدي إلى تنشيط الشلال المقلص. انظر الشكل 2 أ للحصول على صور تمثيلية للخلايا المتقلصة غير المحفزة والمحفزة.
- خفف 1 مجم من مسحوق الأيونومايسين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد لعمل محلول مخزون 10 مجم / مل ، وتخزين 10 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف محلول الأيونوميسين 1:10 في وسط SMC لتحضير محلول العمل لإضافته إلى الخلايا.
- قم بإجراء تحفيز الخلية بينما لا تزال المصفوفة في حامل المصفوفة داخل حاضنة زراعة الخلايا ويتم توصيل الأقطاب الكهربائية بالنظام.
- لتحفيز الخلايا ، قم بإزالة الغطاء وضعه على سطح معقم داخل الحاضنة. قم بإعداد ماصتين، مثبتتين على 2 ميكرولتر و 150 ميكرولتر.
- قبل بدء التحفيز ، اضغط على Mark في البرنامج وضع تعليق.
ملاحظة: سيسهل ذلك العثور على التوقيت الدقيق للتحفيز عند تحليل البيانات.
- الماصة 2 ميكرولتر من محلول عمل الأيونوميسين في كل بئر في أسرع وقت ممكن. بمجرد تحفيز جميع الخلايا ، امزج الوسط في الآبار باستخدام الماصة الثانية.
ملاحظة: نظرا للتأثيرات السريعة ، ليس من الضروري تغيير الأطراف بين خطوط الخلايا والظروف المختلفة. اعمل بسرعة أثناء التحفيز والخلط لأن الأيونومايسين له تأثير حاد. عند تحفيز لوحة كاملة ، قم بتحفيز 3 أعمدة كحد أقصى في وقت واحد. بعد كل تحفيز ، انتظر 30 دقيقة على الأقل حتى التحفيز التالي للسماح للخلايا بالتعافي من درجة الحرارة وتغير ثاني أكسيد الكربون الناتج عن فتح باب الحاضنة.
- مباشرة بعد الانتهاء من التحفيز ، اضغط على Mark مرة أخرى لإضافة تعليق يفيد بأن التحفيز قد تم.
- الانتهاء من تجربة التحفيز
- سجل قيم المعاوقة لمدة 5 دقائق تقريبا بعد تحفيز الأيونومايسين. قم بإنهاء التسجيل بالضغط على إنهاء.
