فحص خيوط الأكتين الانزلاقية: اختبار الحركة في المختبر لدراسة انتقال خيوط الأكتين على الميوسين المعطل

الملخص

المصدر: Tripathi, A., et al. التكيفات الخاصة بالميوسين لمقايسات الحركة القائمة على الفحص المجهري الفلوري في المختبر. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء فحص الحركة في المختبر لتحليل تفاعلات الأكتين والميوسين. يتم تصور الحركة الانزلاقية لخيوط الأكتين على جزيئات الميوسين المجمدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص خيوط الأكتين الانزلاقية

1. إعداد الغطاء
   1. اصنع محلول نيتروسليلوز بنسبة 1٪ في أسيتات الأميل.
   2. احصل على طبق زراعة المناديل (150 × 25 مم) وأضف ورق ترشيح دائري (قطر 125 مم) إلى قاع الطبق.
   3. قم بتحميل ثمانية أغطية مربعة بسمك 1.5 مم على رف واغسلها بحوالي 2-5 مل من الإيثانول 200 متبوعا ب 2-5 مل من الماء المقطر (dH₂O). كرر خطوة الغسيل هذه ، وتنتهي بالماء. بعد ذلك ، جفف الغطية تماما باستخدام خط هواء مفلتر أو خط N₂.
   4. خذ غطاء غطاء واحد وقم بسحب 10 ميكرولتر ببطء من محلول النيتروسليلوز بنسبة 1٪ على طول حافة واحدة من الانزلاق. بعد ذلك، بحركة واحدة سلسة، قم بتلطيخها عبر بقية الغطاء باستخدام جانب طرف ماصة أملس الجوانب سعة 200 ميكرولتر. ضع هذا الغطاء على طبق زراعة المناديل مع وضع جانب النيتروسليلوز لأعلى. كرر مع الغطاء المتبقي واتركه حتى يجف أثناء تحضير الكواشف المتبقية ، واستخدم أغطية في غضون 24 ساعة بعد الطلاء.
2. تحضير الغرفة
   1. امسح شريحة المجهر بورق عدسة بصري لتنظيف الحطام الكبير. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين ، بطول 2 سم تقريبا.
   2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط حوالي 2 مم أسفل القطعة الأولى من الشريط بحيث يكون الاثنان متوازيين ومحاذاة. يؤدي هذا إلى إنشاء غرفة تدفق يمكنها استيعاب ما يقرب من 10 ميكرولتر من المحلول (انظر الشكل 1).
   3. خذ واحدة من أغطية المغلفة بالنيتروسليلوز من الجزء 1. قم بلصق الغطاء بعناية على الشريط بحيث يكون الجانب المطلي بالنيتروسليلوز يتلامس مباشرة مع الشريط (انظر الشكل 1). باستخدام طرف الماصة، اضغط برفق على واجهة الشريط المنزلق للتأكد من أن الغطاء قد التصاق بشكل صحيح بالشريحة. قطع الشريط الزائد المعلق على حافة الشريحة بشفرة حلاقة.
3. تحضير الأكتين
   1. اصنع 20 ميكرومتر من الأكتين عن طريق بلمرة الأكتين الكروي (G-actin) في مخزن البلمرة المؤقت (50 ملي مولار KCl ، 2 ملي مولار MgCl₂ ، 1 ملي مولار DTT ، 25 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.0) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   2. تمييع F-actin إلى 5 ميكرومتر في المخزن المؤقت للحركة (20 ملي مولار MOPS ، 5 ملي مولار MgCl₂ ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي DTT (الرقم الهيدروجيني 7.4)). ملصق يحتوي على 1.2x مولار على الأقل من الرودامين فالويدين. اتركيه (مغطى بورق الألمنيوم) لمدة 2 ساعة على الأقل على الثلج. يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 1-2 أشهر ، وتخزينه على الثلج.
4. إجراء مقايسة خيوط الأكتين الشراعية الميوسين 5a
   ملاحظة: في هذا القسم ، يتم توفير تفاصيل مقايسة الانزلاق myosin 5a (HMM).
   1. قم بإعداد حلول الميوسين 5 أ الموضحة في الجدول 1 واحتفظ بها على الجليد.
   2. تدفق في 10 ميكرولتر من الميوسين 5 أ (50-100 نانومتر) عبر غرفة التدفق وانتظر لمدة 1 دقيقة.
   3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل BSA في 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT (المخزن المؤقت "منخفض الملح"). كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية المناديل الورقية أو ورق الترشيح لسحب المحلول عبر القناة عن طريق وضع زاوية الورق برفق عند مخرج حجرة التدفق.
   4. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
   5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول الأكتين الأسود (5 ميكرومتر F-actin ، و 1 ميكرومتر كالمودولين ، و 1 ملي مولار ATP في 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT) للقضاء على "الرؤوس الميتة".
      1. ماصة المحلول بحقنة 1 مل وإبرة 27 جم لقص خيوط الأكتين قبل إدخال المحلول إلى الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد المرة الثالثة. يكفي ما يقرب من 20 حدثا لسحب العينات.
      2. لإجراء دوران "الرأس الميت" ، أضف كمية متكافئة من F-actin إلى الميوسين في وجود 1 ملي مولار ATP و 1 ملي مولار MgCl₂ بتركيز ملح يبلغ 500 مليمتر. ثم جهاز الطرد المركزي الفائق عند 480،000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سيكون الميوسين الميت في الحبيبات.
   6. تدفق في 50 ميكرولتر من 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT و 1 ملي مولار ATP لاستنفاد غرفة خيوط الأكتين الحرة.
   7. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لاستنفاد الغرفة من أي ATP.
   8. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول الأكتين الرودامين 20 نانومتر (Rh-Actin) الذي يحتوي على 1 ملي مولار DTT في 50 ملي ميغابايت وانتظر لمدة دقيقة واحدة للسماح بالارتباط الصارم لخيوط الأكتين بالميوسين 5 أ المتصل بسطح الغطاء.
   9. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT لغسل خيوط Rh-Actin غير المرتبطة بالسطح. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
   10. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي.
   11. سجل الصور على مجهر مضان باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 561 نانومتر لتصور Rh-Actin. وقت التعريض المناسب هو 200 مللي ثانية عند طاقة ليزر 1.4 ميجاوات لمدة اكتساب إجمالية تتراوح من 0.5 إلى 1 دقيقة < br / > ملاحظة: تأكد من قياس معدل الاستحواذ بشكل مناسب لسرعة الخيوط المتحركة. أحد الاعتبارات المهمة قبل جمع البيانات لاستخدامها مع برامج التتبع هو معدل إطارات الاستحواذ. ستؤدي حركات البكسل الفرعي بين الإطارات إلى تقدير مبالغ فيه للسرعة ، وحركات عدة مئات من النانومترات مطلوبة للحصول على قيم دقيقة. يتميز معدل الاستحواذ الأمثل بانزلاق الأكتين لمسافة بكسل واحد على الأقل بين الإطارات. في حالة مجهر TIRF المستخدم للتصوير هنا ، تترجم هذه العتبة إلى 130 نانومتر. ولذلك، يجب تصوير الميوسين المتوقع أن ينتقل بمقدار 1 ميكرومتر/ثانية بمعدل 5 إطارات/ثانية (فاصل زمني 0,2 ثانية) لتحقيق 200 نانومتر من الحركة، بينما يتطلب الميوسين المتوقع أن ينتقل بسرعة 10 نانومتر/ثانية 0,05 إطار/ثانية (فواصل زمنية قدرها 20 ثانية). لذلك يمكن تقليل البيانات في هذه المرحلة إذا لزم الأمر.

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في فحص الانزلاق

اسم المخزن المؤقت التركيب (M5a) التركيب (NM2b) الخطوة (الخطوات) المستخدمة (M5a / NM2b) التعليقات 4X المخزن المؤقت للحركة (4X MB) 80 ملي مولار ماسح للمعادن، الرقم الهيدروجيني 7.2 80 ملي مولار ماسح للمعادن، الرقم الهيدروجيني 7.2 قم بتصفية الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية 20 ملي ملجمCl2 20 ملي ملجمCl2 0.4 ملي مولار EGTA 0.4 ملي مولار EGTA الرقم الهيدروجيني 7.4 الرقم الهيدروجيني 7.4 50 ملي مولار عازلة حركة الملح (50 ملي ميجابايت) 25٪ حجم/حجم 4X ميجابايت 25٪ حجم/حجم 4X ميجابايت قم بتصفية الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية 50 ملي كيلوسيل 50 ملي كلوريد الصوديوم ارفع إلى مستوى الصوت باستخدام dH2O ارفع إلى مستوى الصوت باستخدام dH2O 500 ملي مولار عازلة حركة الملح (500 ملي ميجابايت) N / A 25٪ حجم/حجم 4X ميجابايت قم بتصفية الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية 500 ملي كلوريد الصوديوم ارفع إلى مستوى الصوت باستخدام dH2O Myosin 0.05-0.1 ميكرومتر ميوسين 0.2 ميكرومتر ميوسين 4.2 استمر في الجليد. 1 ملي DTT 1 ملي DTT تمييع في 50 ملي ميغابايت تمييع في 500 ملي ميغابايت 1 مجم / مل ألبومين مصل الأبقار (BSA) 1 مجم / مل BSA 1 مجم / مل BSA 4.3 استمر في الجليد. تمييع في 50 ملي ميغابايت تمييع في 500 ملي ميغابايت 1 ملي DTT 1 ملي DTT 5 ميكرومتر F-actin غير المسمى في 50 ملي ميغابايت (أكتين أسود) 5 ميكرومتر F-actin غير المسمى 5 ميكرومتر F-actin غير المسمى 4.5 ابق على الجليد. قص الأكتين عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 5-10 مرات ، أو باستخدام حقنة. 1 ميكرومتر كالمودولين (CaM) 1 ملي متر ATP 1 ملي متر ATP 0.2 ملي CaCl2 تمييع في 50 ملي ميغابايت 1 ميكرومتر CaM 1-10 نانومتر ميوسين كيناز السلسلة الخفيفة (MLCK) تمييع في 50 ملي ميغابايت ميجابايت مع 1 ملي متر DTT و 1 ملي متر ATP 1 ملي DTT 1 ملي DTT 4.6 استمر في الجليد. 1 ملي متر ATP 1 ملي متر ATP تمييع في 50 ملي ميغابايت تمييع في 50 ملي ميغابايت ميجابايت مع DTT 1 ملي DTT 1 ملي DTT 4.4 ، 4.7 ، 4.9 استمر في وضع الجليد. تمييع في 50 ملي ميغابايت تمييع في 50 ملي ميغابايت 20 نانومتر الرودامين فالويدين F-actin (Rh-Actin) 20 نانومتر الرودامين الفالودين F-actin 20 نانومتر الرودامين الفالودين F-actin 4.8 ابق على الجليد. لا تدوام. 1 ملي DTT 1 ملي DTT تمييع في 50 ملي ميغابايت تمييع في 50 ملي ميغابايت المخزن المؤقت النهائي 50 ملي كيلوسيل 0.7٪ ميثيل السليلوز (اختياري) 4.10 أضف الجلوكوز وأوكسيداز الجلوكوز والكاتالاز مباشرة قبل إجراء التجربة. ابق على الجليد. 20 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 50 ملي كلوريد الصوديوم 5 ملي مللي كلوريد 2 20 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 0.1 ملي مولار EGTA 5 ملي مللي كلوريد 2 1 ملي متر ATP 0.1 ملي مولار EGTA 50 ملي DTT 1 ملي متر ATP 1 ميكرومتر كالمودولين 50 ملي DTT 2.5 مجم / مل جلوكوز 1-10 نانومتر MLCK 100 ميكروغرام / مل جلوكوز أوكسيديز 0.2 ملي CaCl2 40 ميكروغرام / مل كاتالاز 1 ميكرومتر كالمودولين 2.5 مجم / مل جلوكوز 100 ميكروغرام / مل جلوكوز أوكسيديز 40 ميكروغرام / مل كاتالاز

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إعداد غرف خلايا التدفق الوظيفية. (أ) ابدأ بشريحة مجهر نظيفة ، وقطعتين من الشريط على الوجهين مقطوعة إلى حوالي 2 سم ، وغطاء وظيفي. (ب) أضف الشريط إلى منتصف شريحة المجهر. (ج) قم بتوصيل الغطاء بالشريط بحيث يكون الطلاء (أي النيتروسليلوز) متجها لأسفل واضغط برفق على المناطق المتداخلة مع الشريط باستخدام طرف ماصة بلاستيكي للتأكد من أن الغط...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أسيتات الأميل لاد للصناعات البحثية 10825 ATP ميليبور سيجما أ 7699 ألبومين مصل الأبقار ميليبور سيجما 5470 م كالمودولين PMID: 2985564 كاتالاز ميليبور سيجما سي 40 ورق ترشيح دائري - فحص الانزلاق ميليبور سيجما WHA1001125 رف الغطاء ميليبور سيجما Z688568-1EA Coverslips: فحص خيوط التمثيل الانزلاقي VWR الدولية 48366-227 دي إل ديثيوثريتول ميليبور سيجما د0632 شريط على الوجهين مستودع المكاتب 909955 EGTA ميليبور سيجما [إ4378] ايثانول فيشر العلمية أ 4094 جي أكتين PMID: 4254541 يمكن تخزين مخزون G-actin عند 200 ميكرومتر في N2 السائل. الجلوكوز ميليبور سيجما G8270 الجلوكوز أوكسيديز ميليبور سيجما جي 2133 كيه سي إل فيشر العلمية P217-500 أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة فيشر العلمية 02-707-134 ميثيل السليلوز ميليبور سيجما م 0512 شرائح المجهر فيشر العلمية 12-553-10 المماسح فيشر العلمية BP308-100 النيتروسليلوز لاد للصناعات البحثية 10800 [م] شفرات الحلاقه مستودع المكاتب 397492 الرودامين - فالويد ثيرموفيشر العلمي التوصية 415 يمكن تخفيف المخزون في 100٪ من الميثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر. طبق زراعة الأنسجة - فحص الانزلاق كورنينج 353025 يمكن أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من تسعة أغطية. أطراف ماصة ناعمة الجوانب 200 ميكرولتر توماس العلمية 1158U38 معدات الطرد المركزي ثيرموفيشر العلمي 75006590 مجهر نيكون الموديل: Eclipse Ti مع نظام H-TIRF مع هدف 100x TIRF (NA 1.49) كاميرا مجهر أندور الموديل: كاميرا iXon DU888 EMCCD (تنسيق مستشعر 1024 × 1024) صندوق التحكم البيئي المجهر توكاي هيت صندوق حراري مخصص وحدة الليزر المجهري نيكون LU-n4 أربع وحدات ليزر مع ليزر الحالة الصلبة ل 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر Optima Max-XP جهاز طرد مركزي فائق الطاولة بيكمان كولتر 393315