فحص الحركة المقلوبة: تقنية في المختبر لتصور حركة الميوسين على خيوط الأكتين المجمدة

الملخص

المصدر: Tripathi, A., et al. التكيفات الخاصة بالميوسين لمقايسات الحركة القائمة على الفحص المجهري الفلوري في المختبر. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء فحص الحركة في المختبر لتحليل تفاعلات الأكتين والميوسين. يتم تصور الحركة الانزلاقية لخيوط الأكتين على جزيئات الميوسين المجمدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية البروتين

1. تحلل الخلايا واستخراج البروتين
   1. قم بإعداد مخزن مؤقت للاستخراج 1.5x بناء على الجدول 1. قم بالتصفية والتخزين عند 4 درجات مئوية.
   2. ابدأ في إذابة كريات الخلية على الجليد. أثناء ذوبان الكريات ، استكمل 100 مل من محلول الاستخراج مع 1.2 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، و 5 ميكروغرام / مل ليوببتين ، و 0.5 ميكرومتر من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) ، وقرصين مثبطات للبروتياز. ابق على الجليد.
   3. بمجرد ذوبان الحبيبات ، أضف 1 مل من مخزن الاستخراج المكمل لكل 10 مل من زراعة الخلايا. فمثلا, إذا تشكلت كريات الخلية من 500 مل من زراعة الخلايا, ثم أضف 50 مل من المخزن المؤقت للاستخراج المكمل إلى الحبيبات.
   4. قم بتقطيع حبيبات الخلية مع إبقائها على الجليد. لكل بيليه, استخدم الشروط التالية: 5 ثوان ON, 5 ثوان OFF, مدة 5 دقائق, الطاقة 4-5.
   5. اجمع كل المحللات المتجانسة في دورق وأضف ATP (محلول مخزون 0.1 M ؛ درجة الحموضة 7.0) بحيث يكون التركيز النهائي ل ATP 1 مليمتر. يقلب لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة. يفصل ATP الميوسين النشط عن الأكتين ، مما يسمح بفصله في خطوة الطرد المركزي التالية. ولذلك، من الضروري الانتقال إلى الخطوة التالية على الفور للتقليل إلى أدنى حد ممكن من استنفاد ATP وإعادة إلزامه بالأكتين.
   6. جهاز الطرد المركزي المحلل عند 48,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. أثناء حدوث ذلك ، ابدأ في غسل 1-5 مل من ملاط 50٪ من راتنج التقارب المضاد ل FLAG (للحبيبات المكونة من 1 لتر من الخلايا) مع 100 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. على سبيل المثال ، للحصول على 5 مل من الراتنج ، اغسل 10 مل من ملاط 50٪. في خطوة الغسيل النهائية ، أعد تعليق الراتنج ب 1-5 مل من PBS بحجم كاف لإنشاء ملاط بنسبة 50٪.
   7. بعد الطرد المركزي المحلل ، امزج المادة الطافية مع ملاط الراتنج المغسول والصخور برفق في الغرفة الباردة لمدة 1-4 ساعات. أثناء الانتظار ، قم بعمل المخازن المؤقتة الموضحة في الجدول 1 واحتفظ بها على الجليد.
2. إعداد تنقية تقارب FLAG
   جهاز
   1. الطرد المركزي للمحلول في الخطوة 1.7 عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. سيتم تعبئة الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب. دون إزعاج الراتنج ، قم بإزالة المادة الطافية.
   2. أعد تعليق الراتنج في 50 مل من العازلة A كما هو مفصل في الجدول 1 وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. دون إزعاج الراتنج ، قم بإزالة المادة الطافية.
   3. أعد تعليق الراتنج في 50 مل من العازلة B كما هو مفصل في الجدول 1 وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى وأعد تعليق الراتنج في 20 مل من العازلة B. بعد ذلك ، امزج الراتنج والمخزن المؤقت جيدا عن طريق قلب الأنبوب يدويا برفق 10 مرات تقريبا.
3. شطف البروتين وتركيزه
   1. اصنع 30 مل من Elution Buffer كما هو موضح في الجدول 1 واتركه يبرد على الجليد.
   2. قم بإعداد عمود الشطف في غرفة باردة. صب ملاط الراتنج برفق في العمود. اغسل العمود بأحجام 1-2 عمود من Buffer B حيث يتم تغليف الراتنج في الأسفل ، مع التأكد من عدم جفاف الراتنج.
   3. قم بتدفق 1 مل من Elution Buffer عبر الراتنج واجمع التدفق في أنبوب سعة 1.5 مل. كرر بحيث يتم جمع 12 ، 1 مل من الكسور.
   4. في هذه المرحلة ، قم بإجراء اختبار برادفورد الخام على الكسور لتحديد الكسور الأكثر تركيزا نوعيا. على صف واحد من صفيحة 96 بئرا ، ماصة 60 ميكرولتر 1x كاشف برادفورد. عندما يتم جمع الكسور ، امزج 20 ميكرولتر من كل جزء لكل بئر. يشير اللون الأزرق الداكن إلى الكسور الأكثر تركيزا.
   5. في أنبوب سعة 50 مل ، اجمع البروتين المتبقي عن طريق سحب المخزن المؤقت المتبقي برفق عبر العمود ، لتحرير أي ميوسين متبقي مرتبط بالراتنج في تدفق العمود. سيتم تركيز هذا التدفق في الخطوة التالية. تأكد من تجديد الراتنج بعد ذلك لإعادة استخدامه وتخزينه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   6. قم بتجميع الكسور الثلاثة الأكثر تركيزا وقم بتركيز التدفق بشكل أكبر في أنبوب 50 مل بالإضافة إلى الكسور المتبقية سعة 1 مل باستخدام أنبوب تركيز 100,000 MWCO. قم بتحميل العينة المجمعة على أنبوب التركيز وجهاز الطرد المركزي عند 750 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وكرر العملية حتى يتم تركيز كل البروتين المغطى إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 0.5-1 مل><. ملاحظه: يسمح حجم المسام هذا بالاحتفاظ بجزيئات الميوسين ، التي لها كتل عدة أضعاف قطع الوزن الجزيئي. تظل السلاسل الخفيفة مرتبطة بإحكام بالمجالات الحركية خلال هذا المسار الزمني للتركيز ، كما تم التحقق منه من خلال إجراء الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE على المنتج النهائي.
4. غسيل الكلى والتجميد السريع
   1. اصنع 2 لتر من عازلة غسيل الكلى ، كما هو موضح في الجدول 1. قم بتحميل العينة في كيس أو غرفة غسيل الكلى وغسيل الكلى طوال الليل في الغرفة الباردة><. ملاحظه: في حالة M5a-HMM ، بعد غسيل الكلى طوال الليل ، سيكون البروتين نقيا بدرجة كافية لاستخدامه في المقايسات اللاحقة. يمكن إجراء المزيد من خطوات التنقية مثل ترشيح الهلام أو كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، إذا لزم الأمر.
5. استعادة الميوسين بعد غسيل الكلى
   1. بالنسبة إلى M5a-HMM ، اجمع العينة بأكملها بعناية من غرفة غسيل الكلى وجهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 49,000 × جم في حالة وجود أي مجاميع غير مرغوب فيها. خذ المادة الطافية.
6. تحديد التركيز والتجميد السريع
   1. لتحديد تركيز المنتج ، قم بقياس الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي بأطوال موجية 260 و 280 و 290 و 320 نانومتر. احسب التركيز بالملغم / مل (ج_{مجم / مل)} باستخدام المعادلة 1 ، حيث يمثل A₂₈₀ الامتصاص عند 280 نانومتر و A₃₂₀ يمثل الامتصاص عند 320 نانومتر. يمكن تحويل التركيز الناتج بالملغم / مل إلى ميكرومتر من جزيئات الميوسين مع المعادلة 2 ، حيث M هو الوزن الجزيئي للبروتين بأكمله (بما في ذلك السلاسل الثقيلة والسلاسل الخفيفة والفلوروفورات وجميع العلامات).
      ج_{ملغم / مل} = (أ₂₈₀ - أ₃₂₀) / ε (1) < / > جزيئات ميكرو مولار = 1000ج_{مجم / مل} / م (2) < br / > ملاحظه: إذا كان التخفيف ضروريا ، فيجب أن يتم ذلك في مخزن مؤقت عالي القوة الأيونية. يمكن تحديد معامل الانقراض (ε) عن طريق استيراد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين إلى برنامج مثل ExPASy. يبلغ العائد النموذجي ل M5a-HMM حوالي 0.5-1 مل من 1-5 مجم / مل من البروتين. كان معامل الانقراض ل M5a-HMM المستخدم في هذه الورقة 0.671.
   2. قم بتخزين الميوسين المنقى بإحدى الطريقتين. قم بنقل ما بين 10-20 ميكرولتر في أنبوب رقيق الجدران ، مثل أنبوب تفاعل سلسلة البلمرة ، وقم بإسقاط الأنبوب في وعاء من النيتروجين السائل للتجميد السريع. بدلا من ذلك ، قم مباشرة بإدخال ما بين 20-25 ميكرولتر من الميوسين في النيتروجين السائل وتخزين حبات البروتين المجمدة في أنابيب مبردة معقمة. في كلتا الحالتين ، يمكن تخزين الأنابيب الناتجة في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل للاستخدام في المستقبل><. ملاحظه: نظرا لأن مقايسة الحركة الموضحة أدناه تتطلب كميات صغيرة جدا من البروتين ، فإن التخزين في حصص صغيرة ، كما هو موضح ، اقتصادي.

2. فحص TIRF أحادي الجزيء

1. إعداد الغطاء
   1. قسم مسحوق المرق إلى 10 مجم من الحصص (في أنابيب 1.5 مل) من ميثوكسي-بيج-سيلان (mPEG) و 10 ملغ من البيوتين-بيج-سيلان (bPEG). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في وعاء محكم الغلق وخالي من الرطوبة ويستخدم في غضون 6 أشهر.
   2. قم بتحميل ثمانية أغطية مربعة بسمك 1.5H (عالية الدقة) مقاس 22 مم على رف واغسلها ب 2-5 مل من الإيثانول 200 متبوعا ب 2-5 مل من الماء المقطر. كرر خطوة الغسيل هذه ، وتنتهي بالماء. بعد ذلك ، جفف الأغطية تماما باستخدام خط هواء أو N₂ وتنظيف البلازما بالأرجون لمدة 3 دقائق.
   3. ضع الغطاء النظيف على ورق ترشيح (90 مم) في طبق زراعة المناديل (100 × 20 مم) واحتضانه في فرن 70 درجة مئوية أثناء تنفيذ الخطوات التالية.
      ملاحظة: يمكن استبدال تنظيف البلازما بطرق تنظيف كيميائية أخرى.
   4. قم بإعداد محلول الإيثانول بنسبة 80٪ مع dH₂O واضبط الرقم الهيدروجيني على 2.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، أضف 1 مل من هذا إلى 10 مجم من mPEG و 1 مل إلى 10 مجم من bPEG. دوامة لتذوب ، والتي يجب ألا تستغرق أكثر من 30 ثانية.
   5. خذ 100 ميكرولتر من محلول bPEG وأضف 900 ميكرولتر من 80٪ إيثانول (درجة الحموضة 2.0). هذا المحلول هو 1 مجم / مل bPEG. ثم قم بعمل محلول لكل من PEGs على النحو التالي ، واخلطه جيدا.
      1. 200 ميكرولتر من 10 مجم / مل mPEG (التركيز النهائي: 2 مجم / مل).
      2. 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل bPEG (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل).
      3. 790 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 80٪ (درجة الحموضة 2.0).
   6. أخرج الغطية من الفرن. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول PEG بعناية على مركز كل غطاء ، مع التأكد من أن السطح العلوي فقط مبلل. ثم ضع الزلات مرة أخرى في الفرن واحتضنها لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
   7. عندما تبدأ الأغطية في اتخاذ مظهر ثقبي ، مع ظهور دوائر صغيرة عبر السطح ، أخرجها من الفرن.
   8. اغسل كل غطاء بالإيثانول بنسبة 100٪ ، وجففه بخط هواء ، ثم ضعه في الفرن مرة أخرى. احتضان فقط للوقت اللازم لإنشاء الغرف في الخطوة 2.
2. تحضير الغرفة
   1. قم بتنظيف شريحة المجهر لاستخدامها في صنع الغرفة. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين ، بطول 2 سم تقريبا.
   2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط حوالي 2 مم أسفل القطعة الأولى من الشريط بحيث يكون الاثنان متوازيين ومحاذاة.
   3. خذ إحدى أغطية الوظيفة من الفرن (تم إنشاؤها في 2.1). قم بلصق الغطاء بعناية على الشريط بحيث يكون الجانب المطلي ب PEG متجها لأسفل ويقوم باتصال مباشر بالشريط ، كما هو موضح في الشكل 1. باستخدام طرف الماصة، اضغط برفق على واجهة الشريط المنزلق للتأكد من أن الغطاء قد التصاق بشكل صحيح بالشريحة.
   4. قطع الشريط الزائد المعلق فوق الشريحة بشفرة حلاقة. يمكن استخدام هذه الغرف على الفور أو وضعها بشكل زوجي في أنبوب سعة 50 مل وتخزينها في فريزر -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. من المهم تخزينها على الفور وإلا سيتحلل السطح.
3. إجراء فحص الفحص المجهري myosin 5a TIRF
   1. قم بإعداد حلول مقايسة الحركة المقلوبة الميوسين 5a الموضحة في الجدول 2 واحتفظ بها على الجليد.
   2. اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT.
   3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل BSA في 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية المناديل الورقية أو ورق الترشيح لفتيل المحلول عبر القناة.
   4. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
   5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في 50 ملي ميغابايت مع 1 ملي مولار DTT وانتظر لمدة 1 دقيقة.
   6. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
   7. تدفق في 10 ميكرولتر من الرودامين أكتين البيوتينيل (bRh-Actin) الذي يحتوي على 1 ملي مولار DTT في 50 ملي ميغابايت وانتظر لمدة 1 دقيقة. في هذه الخطوة، استخدم طرف ماصة كبير الملل وتجنب سحب العينات لأعلى ولأسفل لتقليل قص خيوط الأكتين الفلورية لضمان إمكانية ربط خيوط الأكتين الطويلة بالسطح (20-30 ميكرومتر أو أكثر). البديل الفعال هو قطع مخروط طرف الماصة القياسي (بفتحة ≈1-1.5 مم).
   8. يغسل ب 10 ميكرولتر من 50 ملي ميجابايت مع 1 ملي مولار DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
   9. قم بالتدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي مع إضافة 10 نانومتر ميوسين 5 أ ، ثم قم بالتحميل على الفور على مجهر TIRF وقم بالتسجيل بعد العثور على التركيز الأمثل لطريقة التصوير TIRF. أوقات التعرض بين 100-200 مللي ثانية مناسبة لطاقة ليزر 1.4 ميجاوات للأكتين والميوسين المسمى GFP. وقت الاستحواذ المناسب لتحليل السرعة هو 3 دقائق.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في تنقية البروتين.

اسم المخزن المؤقت تكوين الخطوة (الخطوات) المستخدمة التعليقات M5a المخزن المؤقت للاستخراج 0.3 م كلوريد الصوديوم 1.1 استمر في الجليد. 15 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 15 ملي ملغم كلوريد₂ 1.5 ملي مولار EGTA 4.5 ملي NaN₃ Buffer A 0.5 م كلوريد الصوديوم 2.2 استمر في وضع الجليد. 10 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 0.1 ملي مولار EGTA 3 ملي NaN₃ 1 ملي متر ATP 1 ملي DTT 5 ملي مللي كلوريد₂ Buffer B 0.5 م كلوريد الصوديوم 2.3 استمر في الجليد. 10 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 0.1 ملي مولار EGTA 3 ملي NaN₃ 1 ملي DTT Elution Buffer 0.5 م كلوريد الصوديوم 3.1 ابق على الجليد. 0.5 مجم / مل ببتيد FLAG 10 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 0.1 ملي مولار EGTA 3 ملي NaN₃ الرقم الهيدروجيني 7.2 M5a عازلة غسيل الكلى 500 ملي كيلوسيلتر 4.1 استخدم dH₂O البارد لرفع مستوى الصوت. 10 ملي ملغ كلوريد₂ 10 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 0.1 ملي مولار EGTA 1 ملي DTT

الجدول 2: المخازن المؤقتة المستخدمة في اختبار TIRF.

اسم المخزن المؤقت تكوين الخطوة (الخطوات) المستخدمة التعليقات 4X المخزن المؤقت للحركة (4X MB) 80 ملي مولار ماسح للمعادن، الرقم الهيدروجيني 7.2 قم بتصفية الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية 20 ملي ملغ كلوريد₂ 0.4 ملي مولار EGTA الرقم الهيدروجيني 7.4 50 ملي مولار عازلة حركة الملح (50 ملي ميغابايت) 25٪ حجم/حجم 4X ميجابايت قم بتصفية الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية 50 ملي كيلوسيل ارفع إلى مستوى الصوت باستخدام dH₂O 150 ملي مولار عازلة حركة الملح (150 ملي ميجابايت) قم بفلتر الفراغ وتخزينه في 4 درجات مئوية الميوسين انظر وصفة "العازلة النهائية" ابق على الجليد. 2 مجم / مل نيوترأفيدين 2 مجم / مل نيوترأفيدين 3.5 استمر في الجليد. 1 ملي DTT تمييع في 50 ملي ميغابايت 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) 1 مجم / مل BSA 3.3 استمر في الجليد. 1 ملي DTT تمييع في 50 ملي ميغابايت 200 نانومتر من الرودامين والفالويد الحيوي F-actin (bRh-Actin) 200 نانومتر من الرودامين والفالودين الحيوي F-actin 3.7 تجنب القص عن طريق عدم الدوامة أو سحب العينات لأعلى ولأسفل. للخلط ، اقلبها برفق. 1 ملي DTT تمييع في 50 ملي ميغابايت ميجابايت مع DTT 50 ملي DTT 3.2 ، 3.4 ، 3.6 ، 3.8 استمر في وضع الجليد. تمييع في 50 ملي ميغابايت المخزن المؤقت النهائي 50 ملي كيلوسيل 3.9 أضف الجلوكوز وأوكسيداز الجلوكوز والكاتالاز مباشرة قبل إجراء التجربة. ابق على الجليد. 20 ملي مولار ماسح ، درجة الحموضة 7.2 5 ملي مللي كلوريد₂ 0.1 ملي مولار EGTA 1 ملي متر ATP 50 ملي DTT 1 ميكرومتر كالمودولين 2.5 مجم / مل جلوكوز 100 ميكروغرام / مل جلوكوز أوكسيديز 40 ميكروغرام / مل كاتالاز 10 نانومتر ميوسين

النتائج

الشكل 1: إعداد غرف خلايا التدفق الوظيفية.(أ) ابدأ بشريحة مجهر نظيفة ، وقطعتين من الشريط على الوجهين مقطوعة إلى حوالي 2 سم ، وغطاء وظيفي. (ب) أضف الشريط إلى منتصف شريحة المجهر. (ج) قم بتوصيل الغطاء بالشريط بحيث يكون الطلاء متجها لأسفل واضغط برفق على المناطق المتداخلة بالشريط باستخدام طرف ماصة بلاستيكي للتأكد من أن الغطاء قد التصاق بالغرفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2 م MgCl₂ محلول VWR 10128-298 محلول كلوريد الصوديوم 5 م دينار كويتي الطبي RGE-3270 حمض الخليك ثيرموفيشر العلمي 984303 جل التقارب المضاد ل FLAG M2 ميليبور سيجما أ 2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf ATP ميليبور سيجما أ 7699 بيوتينيل جي أكتين الهيكل الخلوي ، شركة أ ب 07 ألبومين مصل الأبقار ميليبور سيجما 5470 م بي بيج سيلان ليسان بيو ، إنك البيوتين-PEG-SIL-3400-1 جم مركز كاشف برادفورد بيو راد 5000006 كالمودولين PMID: 2985564 كاتالاز ميليبور سيجما سي 40 خط الخلية (Sf9) في SF-900 II SFM ثيرموفيشر العلمي 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf ورق ترشيح دائري - مقايسة مقلوبة ميليبور سيجما WHA1001090 أقراص مثبطة البروتياز الكاملة الخالية من EDTA ميليبور سيجما 5056489001 يجب تخزين هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن استخدام الأقراص مباشرة أو يمكن إعادة تكوينها كمحلول مخزون 25x عن طريق إذابة قرص واحد في 2 مل من الماء المقطر. يمكن تخزين المحلول الناتج عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو 12 أسبوعا على الأقل عند -20 درجة مئوية. أنابيب التركيز (100,000 MWCO) شركة EMD Millipore UFC910024 إن MWCO للأنبوب ليس بالضرورة "مقاس واحد يناسب الجميع" ، طالما أن MWCO أقل من الوزن الجزيئي الكلي للبروتين الذي يتم تنقيته. تم تركيز M5a بأنبوب 30,000 MWCO. صبغة Coomassie Brilliant Blue R-250 ثيرموفيشر العلمي 20278 رف الغطاء ميليبور سيجما Z688568-1EA Coverslips: فحص الحركة المقلوب آزر العلمية ES0107052 أنابيب غسيل الكلى (3500 دالتون MCWO) فيشر العلمية 08-670-5 أ يمكن أن يختلف قطر أنبوب غسيل الكلى ، ولكن يجب أن يكون MWCO هو نفسه. يمكن تخزين الأنابيب في محلول كحول بنسبة 20٪ عند 4 درجات مئوية. دي إل ديثيوثريتول ميليبور سيجما د0632 شريط على الوجهين مستودع المكاتب 909955 DYKDDDDK الببتيد GenScript RP10586 يمكن إذابة هذا في مخزن مؤقت يحتوي على 0.1 M كلوريد الصوديوم ، و 0.1 ملي مولار EGTA ، و 3 ملي مولار من NaN3 ، و 10 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.2) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مجم / مل. يمكن تخزين هذا عند -20 درجة مئوية مثل 300 ميكرولتر من الحصص EGTA ميليبور سيجما [إ4378] عمود الحذف بيو راد 761-1550 يمكن إعادة استخدامها. للتنظيف ، اشطف العمود بأحجام 2-3 أعمدة من PBS والماء المقطر. قم بتبريد العمود عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. ايثانول فيشر العلمية أ 4094 الجلوكوز ميليبور سيجما G8270 الجلوكوز أوكسيديز ميليبور سيجما جي 2133 محلول جلايسين عازل ، 100 ملم ، درجة الحموضة 2-2.5 ، 1 لتر سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-295018 حمض الهيدروكلوريك ميليبور سيجما 320331 كيه سي إل فيشر العلمية P217-500 أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة فيشر العلمية 02-707-134 مثبطات ليوببتين بروتياز ثيرموفيشر العلمي 78435 Mark12 سلم قياسي غير ملوث ثيرموفيشر العلمي ال سي 5677 ميثانول ميليبور سيجما MX0482 شرائح المجهر فيشر العلمية 12-553-10 المماسح فيشر العلمية BP308-100 mPEG-silane ليسان بيو ، إنك MPEG-SIL-2000-1g NaN₃ ميليبور سيجما إس 8032 نيوترأفيدين ثيرموفيشر العلمي 31050 NuPAGE 4 إلى 12٪ جل بروتين صغير Bis-Tris ، 15 جيدا ثيرموفيشر العلمي NP0323PK2 عينة المخزن المؤقت ل NuPAGE LDS (4X) ثيرموفيشر العلمي NP0007 محلول ملحي مخزن بالفوسفات، درجة الحموضة 7.4 ثيرموفيشر العلمي 10010023 PMSF ميليبور سيجما 78830 يمكن صنع PMSF كمحلول مخزون 0.1 متر في الأيزوبروبانول وتخزينه في 4 درجات مئوية. تؤدي إضافة الأيزوبروبانول إلى ترسيب بلوري ، والذي يمكن إذابته عن طريق التقليب في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام مباشرة ، يمكن إضافة PMSF بالتنقيط إلى محلول سريع التحريك إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 ملليمتر. شفرات الحلاقه مستودع المكاتب 397492 الرودامين - فالويد ثيرموفيشر العلمي التوصية 415 يمكن تخفيف المخزون في 100٪ من الميثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر. Sf9 وسائل الإعلام ثيرموفيشر العلمي 12658-027 يجب تخزين هذا في 4 درجات مئوية. مدة صلاحيتها 18 شهرا من تاريخ التصنيع. طبق زراعة الأنسجة - الفحص المقلوب كورنينج 353003 يمكن أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من أربعة أغطية. أطراف ماصة ناعمة الجوانب 200 ميكرولتر توماس العلمية 1158U38 معدات الطرد المركزي ثيرموفيشر العلمي 75006590 مجهر نيكون الموديل: Eclipse Ti مع نظام H-TIRF مع هدف 100x TIRF (NA 1.49) كاميرا مجهر أندور الموديل: كاميرا iXon DU888 EMCCD (تنسيق مستشعر 1024 × 1024) صندوق التحكم البيئي المجهر توكاي هيت صندوق حراري مخصص وحدة الليزر المجهري نيكون LU-n4 أربع وحدات ليزر مع ليزر الحالة الصلبة ل 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر جهاز طرد مركزي منتصف مقاعد البدلاء ثيرموفيشر العلمي الموديل: CR3i ميسونيكس سونيكاتور ميسونيكس XL2020 Optima Max-XP جهاز طرد مركزي فائق الطاولة بيكمان كولتر 393315 منظف البلازما داينر الإلكترونية جي إم بي إتش + كو كيه جي نوع النظام: زيبتو مسبار سونيكاتور (3.2 مم) قوسونيكا 4418 حاضنة قياسية الموثق الموديل: 56 خلاط أنبوب ويفرلي ويفرلي TR6E