فحص الحركة المقلوبة: تقنية في المختبر لتصور حركة الميوسين على خيوط الأكتين المجمدة

الملخص

المصدر: Tripathi, A., et al. التكيفات الخاصة بالميوسين لمقايسات الحركة القائمة على الفحص المجهري الفلوري في المختبر. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء فحص الحركة في المختبر لتحليل تفاعلات الأكتين والميوسين. يتم تصور الحركة الانزلاقية لخيوط الأكتين على جزيئات الميوسين المجمدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تنقية البروتين

1. تحلل الخلايا واستخراج البروتين
   1. قم بإعداد مخزن مؤقت للاستخراج 1.5x بناء على الجدول 1. قم بالتصفية والتخزين عند 4 درجات مئوية.
   2. ابدأ في إذابة كريات الخلية على الجليد. أثناء ذوبان الكريات ، استكمل 100 مل من محلول الاستخراج مع 1.2 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، و 5 ميكروغرام / مل ليوببتين ، و 0.5 ميكرومتر من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) ، وقرصين مثبطات للبروتياز. ابق على الجليد.
   3. بمجرد ذوبان الحبيبات ، أضف 1 مل من مخزن الاستخراج المكمل لكل 10 مل من زراعة الخلايا. فمثلا, إذا تشكلت كريات الخلية من 500 مل من زراعة الخلايا, ثم أضف 50 مل من المخزن المؤقت للاستخراج المكمل إلى....

النتائج

الشكل 1: إعداد غرف خلايا التدفق الوظيفية.(أ) ابدأ بشريحة مجهر نظيفة ، وقطعتين من الشريط على الوجهين مقطوعة إلى حوالي 2 سم ، وغطاء وظيفي. (ب) أضف الشريط إلى منتصف شريحة المجهر. (ج) قم بتوصيل الغطاء بالشريط بحيث يكون الطلاء متجها لأسفل واضغط برفق على المناطق المتداخلة بالشريط باستخدام طرف ماصة بلاستيكي للتأكد من أن الغطاء قد التصاق بالغرفة.

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2 م MgCl₂ محلول VWR 10128-298 محلول كلوريد الصوديوم 5 م دينار كويتي الطبي RGE-3270 حمض الخليك ثيرموفيشر العلمي 984303 جل التقارب المضاد ل FLAG M2 ميليبور سيجما أ 2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf ATP ميليبور سيجما أ 7699 بيوتينيل جي أكتين الهيكل الخلوي ، شركة أ ب 07 ألبومين مصل الأبقار ميليبور سيجما 5470 م بي بيج سيلان ليسان بيو ، إنك البيوتين-PEG-SIL-3400-1 جم مركز كاشف برادفورد بيو راد 5000006 كالمودولين PMID: 2985564 كاتالاز ميليبور سيجما سي 40 خط الخلية (Sf9) في SF-900 II SFM ثيرموفيشر العلمي 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf ورق ترشيح دائري - مقايسة مقلوبة ميليبور سيجما WHA1001090 أقراص مثبطة البروتياز الكاملة الخالية من EDTA ميليبور سيجما 5056489001 يجب تخزين هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن استخدام الأقراص مباشرة أو يمكن إعادة تكوينها كمحلول مخزون 25x عن طريق إذابة قرص واحد في 2 مل من الماء المقطر. يمكن تخزين المحلول الناتج عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو 12 أسبوعا على الأقل عند -20 درجة مئوية. أنابيب التركيز (100,000 MWCO) شركة EMD Millipore UFC910024 إن MWCO للأنبوب ليس بالضرورة "مقاس واحد يناسب الجميع" ، طالما أن MWCO أقل من الوزن الجزيئي الكلي للبروتين الذي يتم تنقيته. تم تركيز M5a بأنبوب 30,000 MWCO. صبغة Coomassie Brilliant Blue R-250 ثيرموفيشر العلمي 20278 رف الغطاء ميليبور سيجما Z688568-1EA Coverslips: فحص الحركة المقلوب آزر العلمية ES0107052 أنابيب غسيل الكلى (3500 دالتون MCWO) فيشر العلمية 08-670-5 أ يمكن أن يختلف قطر أنبوب غسيل الكلى ، ولكن يجب أن يكون MWCO هو نفسه. يمكن تخزين الأنابيب في محلول كحول بنسبة 20٪ عند 4 درجات مئوية. دي إل ديثيوثريتول ميليبور سيجما د0632 شريط على الوجهين مستودع المكاتب 909955 DYKDDDDK الببتيد GenScript RP10586 يمكن إذابة هذا في مخزن مؤقت يحتوي على 0.1 M كلوريد الصوديوم ، و 0.1 ملي مولار EGTA ، و 3 ملي مولار من NaN3 ، و 10 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.2) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مجم / مل. يمكن تخزين هذا عند -20 درجة مئوية مثل 300 ميكرولتر من الحصص EGTA ميليبور سيجما [إ4378] عمود الحذف بيو راد 761-1550 يمكن إعادة استخدامها. للتنظيف ، اشطف العمود بأحجام 2-3 أعمدة من PBS والماء المقطر. قم بتبريد العمود عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. ايثانول فيشر العلمية أ 4094 الجلوكوز ميليبور سيجما G8270 الجلوكوز أوكسيديز ميليبور سيجما جي 2133 محلول جلايسين عازل ، 100 ملم ، درجة الحموضة 2-2.5 ، 1 لتر سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-295018 حمض الهيدروكلوريك ميليبور سيجما 320331 كيه سي إل فيشر العلمية P217-500 أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة فيشر العلمية 02-707-134 مثبطات ليوببتين بروتياز ثيرموفيشر العلمي 78435 Mark12 سلم قياسي غير ملوث ثيرموفيشر العلمي ال سي 5677 ميثانول ميليبور سيجما MX0482 شرائح المجهر فيشر العلمية 12-553-10 المماسح فيشر العلمية BP308-100 mPEG-silane ليسان بيو ، إنك MPEG-SIL-2000-1g NaN₃ ميليبور سيجما إس 8032 نيوترأفيدين ثيرموفيشر العلمي 31050 NuPAGE 4 إلى 12٪ جل بروتين صغير Bis-Tris ، 15 جيدا ثيرموفيشر العلمي NP0323PK2 عينة المخزن المؤقت ل NuPAGE LDS (4X) ثيرموفيشر العلمي NP0007 محلول ملحي مخزن بالفوسفات، درجة الحموضة 7.4 ثيرموفيشر العلمي 10010023 PMSF ميليبور سيجما 78830 يمكن صنع PMSF كمحلول مخزون 0.1 متر في الأيزوبروبانول وتخزينه في 4 درجات مئوية. تؤدي إضافة الأيزوبروبانول إلى ترسيب بلوري ، والذي يمكن إذابته عن طريق التقليب في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام مباشرة ، يمكن إضافة PMSF بالتنقيط إلى محلول سريع التحريك إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 ملليمتر. شفرات الحلاقه مستودع المكاتب 397492 الرودامين - فالويد ثيرموفيشر العلمي التوصية 415 يمكن تخفيف المخزون في 100٪ من الميثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومتر. Sf9 وسائل الإعلام ثيرموفيشر العلمي 12658-027 يجب تخزين هذا في 4 درجات مئوية. مدة صلاحيتها 18 شهرا من تاريخ التصنيع. طبق زراعة الأنسجة - الفحص المقلوب كورنينج 353003 يمكن أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من أربعة أغطية. أطراف ماصة ناعمة الجوانب 200 ميكرولتر توماس العلمية 1158U38 معدات الطرد المركزي ثيرموفيشر العلمي 75006590 مجهر نيكون الموديل: Eclipse Ti مع نظام H-TIRF مع هدف 100x TIRF (NA 1.49) كاميرا مجهر أندور الموديل: كاميرا iXon DU888 EMCCD (تنسيق مستشعر 1024 × 1024) صندوق التحكم البيئي المجهر توكاي هيت صندوق حراري مخصص وحدة الليزر المجهري نيكون LU-n4 أربع وحدات ليزر مع ليزر الحالة الصلبة ل 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر جهاز طرد مركزي منتصف مقاعد البدلاء ثيرموفيشر العلمي الموديل: CR3i ميسونيكس سونيكاتور ميسونيكس XL2020 Optima Max-XP جهاز طرد مركزي فائق الطاولة بيكمان كولتر 393315 منظف البلازما داينر الإلكترونية جي إم بي إتش + كو كيه جي نوع النظام: زيبتو مسبار سونيكاتور (3.2 مم) قوسونيكا 4418 حاضنة قياسية الموثق الموديل: 56 خلاط أنبوب ويفرلي ويفرلي TR6E