مقايسة إطلاق إنزيم الوسيط المتوافق مع البشر: طريقة كيميائية مناعية لفحص إمكانات الحساسية لمستضد الاختبار عن طريق مراقبة استجابة التحلل القاعدي في المختبر

الملخص

المصدر: Wenger ، M. et al. اختبار إصدار الوسيط المتوافق مع البشر كقراءة لفاعلية مسببات الحساسية. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة في المختبر لتقييم إمكانات الحساسية للمستضد للحث على تحلل القاعدي. يستخدم β-hexosaminidase كمؤشر لإطلاق الوسيط الكيميائي ، ويتم قياس نشاط إنزيم β-hexosaminidase باستخدام ركيزة فلورية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسي المحلي

1. التحسس السلبي لخلايا huRBL

1. جهاز طرد مركزي Ag8 / معلق مصل محتضن مسبقا لمدة 5 دقائق عند 250 × جم.
2. انقل 50 ميكرولتر من معلق Ag8 / المصل بالطرد المركزي إلى كل بئر يحتوي على خلايا huRBL دون إزعاج حبيبات خلية Ag8.
   1. قم بتضمين عدم التحكم في المستضد ، وهي حساسة ، ولكن الخلايا غير المحفزة (لا تضيف المستضد) ، والتي تعمل كمؤشر على هضبة / خلفية الإشارة السفلية. لا تحتاج آبار التحكم في التحلل في الخلفية والحد الأقصى إلى الحساسية بالمصل. أضف 50 ميكرولتر من وسط huRBL للتحكم في الآبار بدلا من ذلك.
3. غطي الطبق بالغطاء واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ -7٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

فئة

2. تحلل محفز بالمستضد وإطلاق وسيط

1. قم بإعداد تخفيف المستضد في 1x عازلة Tyrode (9.5 جم / لتر من أملاح Tyrode ، 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.5 جم / لتر كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO₃) في dH₂O) مسبقا. هناك حاجة إلى كمية نهائية قدرها 100 ميكرولتر لكل بئر.
   ملاحظه: قد لا تكون كل مسببات الحساسية ، سواء كانت منقاة من مصادر طبيعية أو منتجة مؤتلفا ، مستقرة في 1x المخزن المؤقت Tyrode. لذلك ، قم بإجراء اختبارات الثبات في 1x المخزن المؤقت ل Tyrode قبل إجراء الفحص. بدلا من ذلك ، قم بتخفيف 1x المخزن المؤقت للتيرود في أكسيد الديوتيريوم (D₂O) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء للمقايس.
2. اصنع 8 تخفيفات من المستضد محل الاهتمام لسلسلة تخفيف 1:10 في أنابيب التفاعل تبدأ إما ب 10 أو 1 ميكروغرام / مل من البروتين.
   ملاحظة: اختبر دائما سلسلة التخفيف مسبقا. بدلا من ذلك ، قم بتكييف سلسلة التخفيف 1:10 (على سبيل المثال ، 1: 5 أو 1:20 أو 1:30) لتغطية منحنى التحرير الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يختلف تركيز البداية اعتمادا على الإعداد التجريبي.
3. لغسل خلايا huRBL المطلية على اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإزالة وسط الخلية المحتوي على الأمصال أولا عن طريق شفط اللوحة بعناية وعكسها والنقر عليها على ورق ماص.
4. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 1x عازلة Tyrodes لكل بئر. تعامل مع جميع الآبار بالمثل.
   ملاحظه: أضف محلول الغسيل ببطء إلى الخلايا حتى لا تزعجها.
5. اتركه لمدة 30 ثانية تقريبا وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات في المجموع.
6. بعد إضافة محلول الغسيل للمرة الأخيرة ، اترك المحلول في الآبار حتى يصبح جاهزا للاستمرار في إضافة تخفيف المستضد.
   ملاحظه: تجنب تعريض الخلايا للهواء لفترة طويلة.
7. انقل 100 ميكرولتر من محلول المستضد إلى كل بئر يحتوي على خلايا huRBL الحساسة مسبقا.
   ملاحظة: في حالة تحليل العديد من المعلمات المختلفة ، قم بنقل العينات الفردية من سلسلة التخفيف إلى صفيحة إضافية غير ملزمة من 96 بئرا (استخدم نفس التصميم الموجود على لوحة huRBL) ونقلها بعد ذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات مباشرة على لوحة خلية huRBL. بهذه الطريقة ، يمكن تجنب تعريض الخلايا للهواء لفترة طويلة جدا ، مما قد يؤدي إلى ضعف أداء الفحص (إشارة أقل / بدون إشارة).
8. قم بتغطية آبار التحكم (أقصى تحلل وخلايا خلفية غير حساسة) ب 100 ميكرولتر من 1x عازلة Tyrode. لا تحفز آبار التحكم هذه بالمستضد.
   1. بالإضافة إلى ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت Tyrode إلى الآبار الحساسة الخالية من المستضد لسلسلة التخفيف ، وهو أمر ضروري لأخذ الإطلاق التلقائي المستقل عن المستضد للخلايا الحساسة في الاعتبار أثناء تحليل البيانات.
9. احتضان خلايا huRBL لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ -7٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

فئة

3. قياس التألق لنشاط β-hexosaminidase

1. عالج الآبار ذات الحد الأقصى للتحكم في التحلل ب 10 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 لكل بئر واخلطها بشكل صحيح من أجل تحلل الخلايا تماما والحصول على إطلاق 100٪ من β-hexosaminidase.
2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى صفيحة جديدة غير ملزمة من 96 بئرا. محلول الركيزة للوحة واحدة ذات 96 بئر: 5 مل من محلول فحص الستريك 0.1 M ، درجة الحموضة 4.5 ؛ و 80 ميكرولتر من 10 ملي مولار 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide.
3. نقل 50 ميكرولتر من الطاف الخلوي لجميع الآبار إلى الصفيحة الجديدة التي تحتوي على محلول الركيزة.
   ملاحظة: قم بإخراج المادة الطافية بعناية من لوحة huRBL حتى لا تعطل خلايا huRBL.
4. احتضان اللوحة بمحلول الركيزة والمادة الطافية للخلية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح بتحويل الركيزة الفلورية.
   ملاحظه: احتفظ بلوحة huRBL لمقايسة صلاحية الخلية.
5. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف (15 جم / لتر جلايسين ، 11.7 جم / لتر كلوريد الصوديوم المذاب في dH₂O ، درجة الحموضة 10.7) لكل بئر.
6. قم بقياس التألق عند إثارة 360 نانومتر وانبعاث 465 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

المواد