العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط: تقنية عالية الإنتاجية لتحديد البروتينات داخل الخلايا المرتبطة بالرسول الثاني للنيوكليوتيدات البكتيرية

1. تلقيح الإشريكية القولونية K-12 ASKA ORFeome سلالات المجموعة في 1.5 مل من مرق Lysogeny (LB) الذي يحتوي على 25 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول في ألواح بئر عميقة 96 بئر. تنمو بين عشية وضحاها (O / N) لمدة 18 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، أضف الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0.5 mM النهائي) إلى مزارع O / N للحث على التعبير عن البروتين عند 30 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
2. خلايا الحبيبات على حرارة 500 × جم لمدة 10 دقائق. قم بتجميد الكريات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لتحلل الخلايا ، أضف 150 ميكرولتر من محلول التحلل L1 (40 ملي مولار Tris pH 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار MgCl₂ ، مكمل ب 2 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 40 ميكروغرام / مل DNase 1 ، و 0.5 مجم / مل ليزوزيم) لإعادة تعليق الحبيبات.
3. قم بتجميد الخلايا عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإذابة الثلج عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر هذه الدورة ثلاث مرات لتحلل الخلايا. قم بتخزين المحللات في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

ملاحظة: البروتينات المؤتلفة Rel_seq من Streptococcus equisimilis و GppA من بكتريا قولونية K-12 تستخدم لتصنيع pppGpp و ppGpp المصنفين بالإشعاع ، على التوالي.

1. تنمو وتجمع الخلايا بشكل مفرط في التعبير عن كل بروتين.
   1. قم بزراعة الإشريكية القولونية BL21 DE3 سلالة حتى المرحلة الأسية (الكثافة البصرية (OD) ~ 0.3-0.4) في مرق LB ، وقم بتدوير 1 مل من المزرعة عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من مرق TSB المثلج (مرق LB مكمل ب 0.1 جم / مل PEG3350 ، 0.05 مل / مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، 20 ملي ملجمCl₂).
   2. امزج البلازميدات التي تحمل relseq و gppA الموسومة بالهيستيدين ، كل 100 نانوغرام ، مع معلقات الخلية المذكورة أعلاه في TSB ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   3. قم بلوحة الخلايا المستردة على ألواح أجار LB المكملة بالمضادات الحيوية المقابلة (Rel_seq: 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. GppA: 30 ميكروغرام / مل كاناميسين). في اليوم التالي ، قم بتلقيح المستعمرات في مرق LB لبدء زراعة O / N لكلتا السلالتين عند 37 درجة مئوية.
   4. بعد 18 ساعة ، قم بتلقيح 500 مل من وسط LB ب 10 مل من مزارع O / N والمضادات الحيوية المقابلة. قم بتنمية الثقافات عن طريق الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. عندما يصل OD_600nm إلى 0.5-0.7 ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 0.5 ملي مولار IPTG والنمو لمدة 3 ساعات عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة.
   5. اجمع الخلايا عن طريق الدوران عند 6084 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من محلول ملحي 1x مخزن للفوسفات (PBS) ، وأعد الطرد المركزي عند 1912 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية ، وتجميد الكريات عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. تنقية تقارب حمض النيكل النتريلوترياتيك (Ni-NTA)
   ملاحظه: من هذه النقطة فصاعدا ، تأكد من أن العينات باردة.
   1. أضف 40 مل من محلول التحلل المثلج البارد L2 (50 ملي مولار Tris pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 10 ملي مولار إيميدازول ، 10 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول مكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني (قرص خال من EDTA ؛ انظر جدول المواد) لإعادة تعليق الحبيبات. Lysing الخلايا عن طريق صوتنة (60٪ سعة ، 2 ثانية ON / 4 S OFF لمدة 8 دقائق على). قم بمسح المحللة عن طريق الدوران عند 23,426 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، واستمر في استخدام المادة الطافية للتنقية.
   2. أثناء الطرد المركزي أعلاه ، قم بإعداد راتنج Ni-NTA.
      1. انقل 500 ميكرولتر من راتنج Ni-NTA المتجانس إلى عمود كروماتوغرافيا بولي بروبلين قائم ، واتركه يستقر لمدة 15 دقيقة ويتم تصريف محلول التخزين من خلاله. اغسل الراتنج ب 15 مل من الماء عالي النقاء مرتين ، ثم اغسل العمود ب 15 مل من عازلة التحلل L2.
   3. قم بتحميل المادة الطافية التي تم تطهيرها من محللة الخلية من الخطوة 1 على العمود ، واتركها تتدفق. اغسل العمود ب 30 مل من محلول الغسيل (50 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 20 ملي إيميدازول).
   4. قم بتصفية البروتينات ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف (50 ملي مولار ، درجة الحموضة ثلاثية 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 500 ملي إيميدازول) ثلاث مرات. ثم كرر الشطف باستخدام 300 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت للشطف. امزج البروتينات المملوءة بحجم نهائي يبلغ 700 ميكرولتر.
3. ترشيح الجل
   1. تحضير مخزن مؤقت للترشيح الهلامي (50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 200 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 5٪ جلسرين). اغسل عمود استبعاد الحجم بحجم عمود واحد (25 مل) من المخزن المؤقت لترشيح الجل.
   2. قم بتحميل العينة المذكورة أعلاه 700 ميكرولتر باستخدام حلقة 500 ميكرولتر ، وقم بتشغيلها بسرعة 0.5 مل / دقيقة ، واجمع 2-3 كسور ، كل منها حجم 0.5 مل ، تحتوي على البروتينات المعنية.
   3. اجمع وركز الكسور التي تحتوي على كل بروتين باستخدام عمود دوران ، وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.

3. توليف ³²pppGpp و ppGpp المسمى P

1. قم بتجميع تفاعل Rel_seq صغير الحجم في أنبوب غطاء لولبي (انظر الجدول 1).
   ملاحظه: العمل مع الكواشف المشعة فقط في مكان مرخص ومع معدات الحماية الشخصية.
2. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري لمدة ساعة واحدة ، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وضعه على الجليد لمدة 5 دقائق. قم بتدوير البروتين المترسب عند 15,700 × جم لمدة 5 دقائق ، وانقل المادة الطافية (مركبة ³²P-pppGpp) إلى أنبوب غطاء لولبي جديد.
3. لتجميع ³²P-ppGpp من ³²P-pppGpp ، انقل نصف منتج ³²P-pppGpp إلى أنبوب غطاء لولبي جديد ، وأضف 1 ميكرومتر GppA. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم ضعه على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. قم بتدوير البروتين المترسب عند 15,700 × جم لمدة 5 دقائق ، وانقل المادة الطافية (المركبة ³²P-ppGpp) إلى أنبوب غطاء لولبي جديد.
5. قم بتحليل ³²P-pppGpp و ³²P-ppGpp عن طريق تشغيل 1 ميكرولتر من العينات على لوحة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة (TLC) (ألواح TLC السليلوز المعدلة بالبولي إيثيلين) باستخدام 1.5 M KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 3.4 ، كمرحلة متحركة.
   ملاحظه: استخدم غوانوزين 5'-ثلاثي الفوسفات المسمى ^α-32P (³²P-α-GTP) كعنصر تحكم.
6. جفف لوحة TLC تماما ، وضعها بين مجلد بلاستيكي شفاف ، وقم بتعريضها لشاشة تخزين فوسفورية لمدة 5 دقائق. تصور الإشارات وتحديدها باستخدام phosphorimager.
   ملاحظه: عندما تكون نسب ³²P-pppGpp و ³²P-ppGpp أعلى من 85٪ ، يمكن تجميع وتصنيع تفاعل واسع النطاق (500 ميكرولتر ، يكفي لفحص 20 لوحة 96 بئرا) باستخدام الجدول 1.

1. قم بإذابة ونقل 20 ميكرولتر من محللات الخلية الكاملة إلى صفيحة ميكروتيتر ذات قاع V سعة 96 بئرا. أضف 2.5 وحدة / بئر من نوكلياز داخلي من Serratia marcescens ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتقليل لزوجة المحلل. ضع المحللات على الثلج لمدة 20 دقيقة.
2. امزج ³²P-pppGpp و ³²P-ppGpp بنسبة 1: 1 ، وأضف 1x المخزن المؤقت للتحلل L1 لجعل التركيز النهائي ل (p) ppGpp يساوي 4 نانومتر < br / > ملاحظه: بالنظر إلى التشابه الكيميائي بين pppGpp و ppGpp ، فإن مزيجا من كلتا المادتين الكيميائيتين سيبسط عملية الفرز.
3. استخدم ماصة متعددة القنوات وأطراف ماصة مفلترة لإضافة وخلط 10 ميكرولتر من خليط (p) ppGpp مع محللة الخلية. احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
4. اغسل أداة الدبوس 96 × عن طريق وضعها في محلول 0.01٪ من المنظفات غير الأيونية لمدة 30 ثانية ، وجففها على المناديل الورقية لمدة 30 ثانية. كرر غسل أداة الدبوس 3x.
5. ضع أداة الدبوس في ألواح العينة المذكورة أعلاه المكونة من 96 بئر ، وانتظر لمدة 30 ثانية. ارفع أداة الدبوس بشكل مستقيم لأعلى ، وضعها لأسفل مباشرة على غشاء النيتروسليلوز لمدة 30 ثانية
   ملاحظه: إذا كانت البقعة مفقودة ، فقم بتحديد 2 ميكرولتر من العينات المقابلة باستخدام ماصة وأطراف مفلترة. ينصح بعمل بقعة مكررة من نفس العينة كما هو موضح أدناه.
6. جفف الغشاء لمدة 5 دقائق في RT. ضع الغشاء بين مجلد بلاستيكي شفاف ، وقم بتعريضه لشاشة تخزين فوسفورية لمدة 5 دقائق.

1. استخدم برنامج التحليل المرتبط بالفوسفور لفتح ملف .gel الخاص باللوحات المرئية. استخدم وظيفة تحليل الصفيف لتحديد 96 نقطة عن طريق إعداد شبكة من 12 عمودا × 8 صفوف.
2. حدد الدوائر الكبيرة لتقييد الحافة الخارجية للبقع بأكملها (انظر الشكل 1). قم بتصدير Volumn + الخلفية والمساحة للدوائر الكبيرة المحددة ، واحفظها في جدول بيانات.
   ملاحظه: إذا لزم الأمر ، قم بتغيير موضع كل دائرة فردية لتتداخل تماما مع البقع ، وقم بتغيير حجم كل دائرة فردية لجعلها أكبر قليلا من البقعة الفعلية.
قم
3. بتقليل حجم الدوائر المحددة لتقييد النقاط الداخلية الصغيرة. قم بتصدير حجم + الخلفية ، ومساحة الدوائر الصغيرة المحددة ، واحفظها في جدول بيانات.
4. احسب كسور الربط في جدول البيانات باستخدام المعادلة في الشكل 1 ، وارسم البيانات. تحديد البروتينات الملزمة المحتملة في الآبار التي تظهر كسورا عالية الارتباط مقارنة بغالبية الآبار الأخرى.

الجدول 1: تجميع المعلومات لتفاعلات التوليف الصغيرة والكبيرة ل ³²pppGpp المسمى P. * يحتوي 10x Relseq المؤقت على 250 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.6 ؛ 1M كلوريد الصوديوم ؛ 80 ملي مولار MgCl₂. الاختصار: pppGpp = غوانوزين خماسي الفوسفات.

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: القياس الكمي وحساب الكسر الملزم. انظر النص للحصول على التفاصيل. باختصار ، سيتم تحليل بقع DRaCALA عن طريق رسم دائرتين تحددان البقعة بأكملها والنقطة المظلمة الداخلية (أي المحتجزة (p) ppGpp بسبب ارتباط البروتين المختبر). إشارة الربط المحددة هي الإشارة المشعة للدائرة الداخلية (S1) بعد طرح إشارة الخلفية غير المحددة (محسوبة بواسطة A1 × ((S2-S 1) / (A2-A 1))). الكسر الملزم هو إشارة الربط المحددة مقسومة على إجمالي الإشارة المشعة (S2). الاختصارات: DRaCALA = العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط ؛ (ع) ppGpp = خماسي الجوانوزين ورباع الفوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة.