مقالة منهجية

مقايسة تصوير مسبار الفلورسنت: تقنية لتصور الإجهاد التأكسدي في الخلايا العضوية المعوية المستزرعة المعالجة بمحفز الأكسجين التفاعلي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Stedman، A. et al.، تحليل الإجهاد التأكسدي في العضيات المعوية في الفئران باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية.

يصف هذا الفيديو تقنية تصور الإجهاد التأكسدي في العضيات المستنبتة. يساعد هذا العمل في فهم مستوى الإجهاد التأكسدي بسبب تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية في أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في العضوية بعد العلاج بمعدلات ROS مختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < p = "jove_title" >1. تصور الإجهاد التأكسدي في العضيات ثلاثية الأبعاد عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر

  1. خذ العضيات المطلية في غرف البئر μ-Slide 8 وأضف 1 ميكرولتر N-acetyl cysteine أو محلول مخزون NAC في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 ملليمتر.
  2. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. أضف 1 ميكرولتر محلول مخزون tBHP في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من التخفيف البالغ 1.25 ملي مولار للمسبار الفلوري للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر.
  6. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 1.25 مجم / مل من Hoechst للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  8. قم بإزالة الوسيط دون إزعاج BMM. أضف برفق 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ بدون الفينول الأحمر.
    ملاحظه: إذا تم التخطيط للاستحواذ على المدى الطويل ، فأضف مركبات عوامل النمو إلى DMEM بدون أحمر الفينول.
  9. قم بتصوير العضيات باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بغرفة حرارية وإمدادات غاز تكتشف المسبار الفلوري (ROS).
    ملاحظه: الإثارة / الانبعاث (ex / em) للمسبار الفلوري هو 644/665 ، ex / em ل Hoechst (النوى) هو 361/486 ، و ex / em ل GFP (الخلايا الجذعية المعوية من الفئران Lgr5-GFP) هو 488/510. يتم استخدام هدف الغمر بالزيت 63x للكشف عن الإشارات في الخلايا الجذعية. لا تقم بتغيير إعدادات الليزر بين العينات. يمكن استخدام هدف 20x للسماح بإلقاء نظرة عامة على إنتاج ROS.
  10. استخدم عنصر التحكم الإيجابي لإعداد شدة الليزر والتعرض الزمني لإشارة ROS والتحقق من أن هذه الإشارة أقل في التحكم السلبي.
  11. باستخدام العدسة ، قم بفحص الشريحة لتحديد عضيات GFP التي تعبر عن وضبط شدة الليزر.
    ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الخطوة يدويا.
  12. حدد المواضع للحصول على صورة مخيطة للعضوية بأكملها. قم بإعداد مكدس z من 25 ميكرومتر (حجم الخطوة 5 ميكرومتر) للحصول على قسم من العضيات يظهر طبقة واحدة من الخلايا.
    ملاحظه: راجع دليل مستخدم المجهر لتحسين الإعداد. باستخدام الخلايا الحية ، يجب أن يتم الاستحواذ في غضون ساعة واحدة بعد نهاية الحضانة.
  13. افتح الصور في برنامج معالجة صور مفتوح المصدر (انظر جدول المواد).
  14. انتقل إلى z-stack واختر القسم الذي يتم فيه تمثيل منتصف العضيات بشكل جيد وقم بإنشاء صورة جديدة بالمنطقة المحددة.
  15. حدد الصور وفقا للخطوات التالية.
    1. حدد أداة الخط اليدوي.
    2. ارسم خطا يتبع النوى.
      ملاحظه: حدد فقط المناطق التي تقدم الخلايا الإيجابية ل GFP إذا تم تحليل الخلايا الجذعية فقط.
    3. قم بزيادة عرض الخط لتغطية طبقة الخلية بالخط دون تضمين الحطام اللمعي.
    4. حدد قناة إشارة ROS وقم بقياس شدة التألق في المنطقة المحددة وقم بالتعليق على القيم.
    5. ارسم خطا حيث لا توجد إشارة وقم بقياس شدة الفلورسنت للخلفية التي سيتم طرحها من القيمة السابقة للحصول على الكثافة النهائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فئران Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP) مختبر جاكسون وسط ثقافة النمو DMEM F12 المتقدم (DMEM / F12) ثيرموفيشر 12634010 البنسلين الستربتومايسين (P / S) ثيرموفيشر 15140122 تركيز المخزون: 100x (10,000 وحدة / مل من البنسلين و 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) FLuoroBrite DMEM (DMEM بدون فينول أحمر) ثيرموفيشر A1896701 هوشت: 33342 ثيرموفيشر H3570 مخزون بمعدل 10 مجم / مل تم تقليل عامل نمو Matrigel ، خال من الفينول الأحمر (مصفوفة الغشاء القاعدي) كورنينج 356231 بمجرد استلام ذوبان الجليد في الثلاجة ، احتفظي به لمدة ساعة واحدة على الثلج ، واصنع 500 مل من الكميات وخزنها في -20 درجة مئوية μ الشريحة 8 غرف بئر المرجع نفسه 80826 ن-أسيتيل سيستين (NAC) سيغما أ 9165 محلول هيدروبيروكسيد ثلاثي بوتيل (tBCHP) (70٪ بالوزن. في H2O2) سيغما 458139 البرامج والمعدات فيجي / ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ تنزيل إنشاء الصور أوبزرفر.Z1 زييس النظام متحد البؤر Opterra (كونفوكال الحقل المكتسح) بروكر النظام متحد البؤر كاميرا EMCCD عالية السرعة Evolve Delta 512 القياسات الضوئية النظام متحد البؤر موشور برنامج GraphPad التحليل الإحصائي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

confocal Hoechst GFP Z stack

مقالات ذات صلة