مقايسة قياس التدفق الخلوي لتحديد الإجهاد التأكسدي: اختبار لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية في العضيات المعوية باستخدام مجسات الفلورية

الملخص

المصدر: Stedman، A.، et al.، تحليل الإجهاد التأكسدي في العضيات المعوية في الفئران باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية.J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو مقايسة قياس التدفق الخلوي لتحديد مستويات ROS في العضيات المعوية ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP. توفر هذه الطريقة نموذجا تجريبيا في المختبر للتحقيق في فعالية مركبات الاختبار على إنتاج ROS.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والمواد لزراعة العضيات المعوية

1. لتحضير وسط زراعة النمو ، امزج DMEM / F-12 المتقدم المكمل ب 1x الجلوتامين ، 1x محلول البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، 10 ملي مولار من HEPES ، 50 نانوغرام / مل من الفئران EGF ، 20 ميكروغرام / مل من الفئران Noggin 500 نانوغرام / مل من الفأر R-Spondin1 (انظر جدول المواد). اترك الوسط في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء استخراج القبو.
   ملاحظه: قم بتجميد الوسط غير المستخدم في حصص عند -20 درجة مئوية. تجنب التجميد والذوبان.
2. املأ أنبوبا سعة 50 مل ب 40 مل من Advanced DMEM / F-12 واحتفظ به على الثلج.
   ملاحظه: احتفظ بالوسط غير المستخدم عند 4 درجات مئوية. سيتم استخدامه للمرور العضوي.
3. قم بتسخين ألواح زراعة الخلايا مسبقا (قاع دائري 96 بئر) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
4. ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) (انظر جدول المواد) على الجليد (قبل بدء البروتوكول أو قبل ساعة واحدة على الأقل من طلاء الخبايا).
   ملاحظه: سوف يتجمد BMM بسرعة إذا لم يظل باردا.
5. تحضير محلول الغسيل / التنظيف عن طريق إضافة محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪ إلى DPBS (DPBS-P / S).
6. املأ طبق بيتري مقاس 100 مم ب 10 مل من DPBS-P / S البارد ، املأ ستة أنابيب سعة 15 مل ب 10 مل من DPBS وقم بتسمياتها من F1 إلى F6.
7. قم بإعداد 30 مل من محلول EDTA 10 ملي عن طريق التخفيف من 0.5 M EDTA في DPBS. املأ أنبوبين سعة 15 مل ب 10 مل من 10 ملي EDTA ، وقم بتسميتها E1 و E2.
8. احتفظ بجميع المحاليل مبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية واحتفظ بها على الجليد أثناء العملية.

فئة

2. ثقافة العضيات المعوية

1. قم بالتضحية بفأرة Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) البالغة من العمر 8-10 أسابيع وفقا للقواعد واللوائح الوطنية.
2. اجمع 5-8 سم من الصائم الذي يشمل المنطقة الواقعة بين الاثني عشر (5 سم من المعدة) والدقاق (10 سم من الأعور) واحتفظ به في بارد DPBS-P / S على الجليد.
3. نظف محتوى الأمعاء عن طريق التنظيف ب 5-10 مل من DPBS-P / S.
   ملاحظه: يمكن الحصول على محاقن التنظيف محلية الصنع عن طريق توصيل طرف 200 ميكرولتر بفوهة حقنة سعة 10 مل.
4. افتح الأمعاء طوليا باستخدام مقص ذو طرف كروي (انظر جدول المواد) (لمنع إتلاف الأنسجة).
5. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على DPBS-P / S بارد في درجة حرارة الغرفة ورجه لشطفه.
6. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، أمسك الأمعاء عن طريق الشفط وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل يسمى E1 يحتوي على 10 مل بارد 10 ملي EDTA.
7. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
8. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، انقل الأنسجة الموجودة في الأنبوب F1 التي تحتوي على 10 مل DPBS. دوامة لمدة دقيقتين (في الدوامة العادية ، أمسك الأنبوب باليد والتأكد من أن الأمعاء تدور بشكل جيد).
9. ضع 10 ميكرولتر من الكسر في طبق بتري وقم بتقييم جودة الكسر تحت المجهر.
   ملاحظه: يتم تنفيذ جميع خطوات الدوامة بأقصى سرعة ، ويجب تقييم جودة كل جزء تحت المجهر (الشكل 1).
10. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، أمسك الأمعاء عن طريق الشفط وانقلها في الأنبوب F2 الذي يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
11. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في الأنبوب F3 الذي يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
12. كرر حضانة EDTA كما في الخطوة 2.6 ، ونقل الأنسجة في الأنبوب E2 التي تحتوي على 10 ملي مولار EDTA.
13. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الجليد لمدة 5 دقائق.
14. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في الأنبوب F4 التي تحتوي على 10 مل DPBS والدوامة لمدة 3 دقائق.
15. كرر الخطوة 2.14 ، ونقل الأنسجة في الأنبوب F5 التي تحتوي على 10 مل DPBS والدوامة لمدة 3 دقائق.
16. كرر الخطوة 2.15 ، ونقل الأنسجة في الأنبوب F6 الذي يحتوي على 10 مل DPBS والدوامة لمدة 3 دقائق.
17. اجمع بين أفضل الكسور التي يتم ترشيحها بالجاذبية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل (على الجليد) للتخلص من الزغابات والحطام الكبير.
    ملاحظه: عادة ما تكون F5 و F6 هي الكسور التي تحتوي على العديد من الخبايا وأقل حطاما.
18. قم بتدوير الخبايا عند 150 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
19. أفرغ الأنبوب, تعطيل الحبيبات ميكانيكيا, وأضف 5 مل من DMEM / F12 الباردة.
20. ضع 10 ميكرولتر من المعلق في طبق بتري واحسب عدد الخبايا الموجودة في aliquot يدويا تحت المجهر.
    ملاحظه: لا تحسب الخلايا المفردة أو الحطام الصغير.
21. احسب الحجم (V) لتعليق الخبايا المطلوب بالميكرولتر ، مع الأخذ في الاعتبار أن 300 سرداب مطلية لكل بئر ، و W هو عدد الآبار ، و N هو عدد الخبايا التي يتم عدها من أصل 10 ميكرولتر من المعلق. انقل الخبايا إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.
    ملاحظه: V = 300 × عرض × 10 / نيوتن. إذا تم استخدام حجم صغير في التجربة المخطط لها ، فيمكن استخدام أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
22. قم بتدوير الخبايا عند 200 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
23. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
24. قم بتعطيل الحبيبات ميكانيكيا وإضافة وسط ثقافة النمو برفق للحصول على تركيز 90 خفا / ميكرولتر.
25. أضف مجلدين من BMM غير المخفف للحصول على تركيز نهائي يبلغ 30 سرداب/ميكرولتر. قم بتدوير الماصة بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.
    ملاحظه: احتفظ دائما بالأنبوب على الجليد لتجنب تصلب BMM.
26. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM تخلط في كل بئر. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، استخدم ألواح مستديرة القاع ذات 96 بئرا. وزعي 10 ميكرولتر في وسط كل بئر كقبة.
    ملاحظه: قم بطلاء العضيات كطبقة رقيقة لمقايسة التصوير لتمكين تصويرها المتعمق.
27. اترك اللوحة لمدة 5 دقائق في RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 15 دقيقة.
28. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر ، مع الحرص على عدم فصل BMM.
29. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
30. قم بإجراء تحليل ROS بين اليومين 4 و 6 من الثقافة. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسط وتقسيم العضيات بعد ظهور العديد من الهياكل الطويلة الناشئة وعندما تتراكم الخلايا الميتة في تجويف العضيات.

< p class = "jove_title" >3. مرور العضيات

1. ابدأ في مرور العضيات المعوية الدقيقة من اليوم السادس من الثقافة ، عندما تشكلت هياكل كبيرة ناشئة ، وأصبحت تجويف العضيات مظلمة><. ملاحظه: يصبح تجويف العضوية مظلما بسبب تراكم الخلايا الميتة والحطام والمخاط. تجنب ترك العضيات تنمو قبل الانقسام. تعتمد نسبة الانقسام على نمو العضيات. يوصى بتمرير العضيات بنسبة 1: 2 في اليوم 6 و 1: 3 في اليوم 10.
2. املأ أنبوبا سعة 15 مل ب 4 مل من Advanced DMEM / F-12 البارد واحتفظ به على الثلج.
   ملاحظه: هنا ، يتم توفير أحجام للوحة ثقافة 96 بئرا. إذا تم استخدام تنسيق مختلف ، فاضبط مستوى الصوت وفقا لذلك.
قم
3. بشفط الوسط بعناية باستخدام ماصة أو مضخة تفريغ من الآبار دون لمس قباب BMM ، وتخلص منه.
4. أضف 100 ميكرولتر من DMEM / F-12 البارد لكل بئر. الماصة لأعلى ولأسفل لكسر BMM ونقل محتوى البئر إلى أنبوب 15 مل.
5. اغسل البئر ب 200 ميكرولتر بارد من Advanced DMEM / F-12 واجمعه في نفس الأنبوب.
   ملاحظه: في حالة مرور آبار متعددة من نفس الحالة التجريبية ، يمكن تجميع محتويات الآبار في نفس أنبوب التجميع سعة 15 مل.
6. قم بتدوير أنبوب التجميع سعة 15 مل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الحبيبات. باستخدام طرف P1000، خذ طرف P10 (بدون فلتر) وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل.
8. أضف 4 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الأنبوب. تدور عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
9. قم بشفط المادة الطافية باستخدام ماصة أو مضخة تفريغ دون إزعاج الحبيبات. ثم قم بتعطيل الحبيبات ميكانيكيا.
10. أضف BMM المخفف في وسط ثقافة النمو (نسبة 2: 1). قم بتدوير الماصة بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.
11. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM تخلط في كل بئر.
12. احتفظ باللوحة لمدة 5 دقائق في RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 15 دقيقة.
13. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر.
    ملاحظه: احرص على عدم فصل BMM.
14. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

< p class = "jove_title" >4. تحضير الكواشف والمواد لتقييم الإجهاد التأكسدي في العضيات المعوية

1. قم بإعداد محلول مخزون 250 ملي من مثبط N-acetylcysteine (NAC) (انظر جدول المواد) ، وأعد تعليق 10 مجم مع 245 ميكرولتر من DPBS. استخدم بتركيز نهائي 1 مليمتر.
2. قم بإعداد محلول مخزون 50 ملي مولار من محفز ترت بوتيل هيدروبيروكسيد (tBHP) ، 70٪ في الماء ، وتخفيف 3.22 ميكرولتر مع 496.8 ميكرولتر من DPBS. يستخدم بتركيز نهائي 200 ميكرومتر.
3. لدراسة قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد محلول عمل 250 ميكرومتر لمسبار الفلوروجينيك (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيف محلول المخزون 1/10 في DMSO. استخدم بتركيز نهائي 1 ميكرومتر.
   ملاحظه: كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة ، فإن المسبار الفلوري حساس للضوء والأكسجين. لا ينبغي فتح الأسهم والحصص وإغلاقها عدة مرات.
4. قم بإعداد محلول نهائي من 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في DPBS ، لاستخدامه في تمييز الخلايا الميتة في مقايسة قياس التدفق الخلوي.
   ملاحظه: تصف هذه الخطوات استخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية التي يجب تضمينها في أي فحوصات ، باستخدام الشروط الموضحة في الشكل 2 أ. يمكن استخدام الفحص لاختبار المركبات المضادة للأكسدة أو المؤيدة للأكسدة. الخطوات هي نفسها ، والفرق الوحيد هو عند إضافة المركبات قبل استخدام الصبغة الفلورية.

< p class = "jove_title" >5. القياس الكمي للإجهاد التأكسدي على العضيات المنفصلة باستخدام مقياس التدفق الخلوي

1. أضف 1 ميكرولتر محلول مخزون NAC في الآبار للضوابط السلبية للحصول على تركيز نهائي قدره 1 مليمتر < br / > ملاحظه: استخدم العضيات المطلية في الألواح المستديرة ذات القاع الدائري المكونة من 96 بئرا.
2. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. أضف 1 ميكرولتر محلول مخزون tBHP في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة الوسيط دون إزعاج BMM المرفق وانقله إلى لوحة سفلية مستديرة أخرى سعة 96 بئرا. اترك هذا الطبق جانبا.
6. أضف 100 ميكرولتر من التربسين ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لتدمير BMM.
7. احتضان لمدة لا تزيد عن 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
8. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لفصل العضيات.
9. تدور عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
10. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة. أضف الوسيط الذي تم جمعه في الخطوة 6.3 مرة أخرى إلى الآبار المقابلة وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 5 مرات.
11. أضف المسبار الفلوري عند التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من التخفيف 250 ميكرومتر واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
    ملاحظه: لا تقم بإضافة المسبار الفلوري إلى الآبار اللازمة لإعدادات الجهاز (الشكل 2 ب).
12. تدور عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
13. أعد تعليق الخلايا ب 250 ميكرولتر من محلول DAPI 0.1 ميكروغرام / مل. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد وتابع التحليل.
    ملاحظه: أضف PBS بدلا من DAPI إلى الآبار اللازمة لإعدادات الجهاز (الشكل 2 ب).
14. قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على التحكم غير الملوثة والجهد الكهربائي بالليزر لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية الصبغة.
15. باستخدام استراتيجية بوابة مناسبة (الشكل 3 أ) ، اجمع ما لا يقل عن 20,000 حدث.
    ملاحظة: يفضل 50,000 حدث. تختلف إعدادات الاستحواذ التفصيلية وفقا للأداة المستخدمة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صور تمثيلية للخبايا والعضويات.(أ) مثال على الكسر F1 الذي تم الحصول عليه بعد الحضانة الأولى باستخدام EDTA ، المخصب بالزغب (مربع) ، مع بعض الحطام (النجمة) والخبايا (الدائرة). (ب) مثال على الكسر F4 المخصب في الخبايا. (ج) التعليق الذي يقدم فقط الخبايا المعزولة التي تم الحصول عليها بعد الترشيح بمصفاة خلية 70 ميكرومتر (شريط مقياس ، 200 ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فئران Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) مختبر جاكسون وسط ثقافة النمو DMEM F12 المتقدم (DMEM / F12) ثيرموفيشر 12634010 مكمل B-27 ناقص فيتامين أ ثيرموفيشر 12587010 تركيز المخزون: 50x جلوتاماكس (الجلوتامين) ثيرموفيشر 35050038 تركيز المخزون: 100x هيبس ثيرموفيشر 15630056 تركيز المخزون: 1 م الفئران EGF البحث والتطوير 2028-EG-200 تركيز المخزون: 500 ميكروغرام / مل في PBS الفئران نوجين البحث والتطوير 1967-NG / CF تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل في PBS الفئران R-spondin1 البحث والتطوير 3474-RS-050 تركيز المخزون: 50 ميكروغرام / مل في PBS ملحق N-2 ثيرموفيشر 17502048 تركيز المخزون: 100x البنسلين الستربتومايسين (P / S) ثيرموفيشر 15140122 تركيز المخزون: 100x (10,000 وحدة / مل من البنسلين و 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) مادي مصفاة خلية 70 ميكرومتر كورنينج هاتف: 352350 قاع دائري 96 بئر كورنينج 3799 مقص طرف الكرة أدوات العلوم الدقيقة GMBH 14086-09 كاشف CellROX® أحمر غامق ثيرموفيشر سي 10422 DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (مسبار الفلورجين) ثيرموفيشر د1306 مخزون بمعدل 10 مجم / مل DPBS 1x بدون كالسيوم بدون مغنيسيوم (DPBS) ثيرموفيشر 14190144 تم تقليل عامل نمو Matrigel ، خال من الفينول الأحمر (مصفوفة الغشاء القاعدي) كورنينج 356231 بمجرد استلام ذوبان الجليد في الثلاجة ، احتفظي به لمدة ساعة واحدة على الثلج ، واصنع 500 مل من الكميات وخزنها في -20 درجة مئوية ن-أسيتيل سيستين (NAC) سيغما أ 9165 محلول هيدروبيروكسيد ثلاثي بوتيل (tBCHP) (70٪ بالوزن. في H2O2) سيغما 458139 إنزيم TrypLE Express (1X) ، خال من الفينول الأحمر (التربسين) ثيرموفيشر 12604013 UltraPure 0.5 M EDTA، درجة الحموضة 8.0 ثيرموفيشر 15575020 Y-27632 سيغما Y0503 مثبط الصخور لاستخدامه لتقليل موت الخلايا عند تفكك الأنسجة البرامج والمعدات Attune NxT (مقياس التدفق الخلوي) ثيرموفيشر محلل مقياس التدفق الخلوي فلولجو BD Bioscience تحليل FACS موشور برنامج GraphPad التحليل الإحصائي