فحص SUMOylation: تقنية في المختبر للكشف عن حالة SUMOylation لبروتينات الركيزة عن طريق النشاف المناعي

الملخص

المصدر: Yang، W. S. et al.، In Vitro SUMOylation Assay لدراسة نشاط SUMO E3 Ligase. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة المختبر لتحويل بروتينات الركيزة باستخدام سلسلة إنزيم متسلسلة. علاوة على ذلك ، يتم تحديد الحالة SUMOylated للبروتين باستخدام تقنية الرحلان الكهربائي والنشاف المناعي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير تركيبات تعبير الفيروس العصبي

1. قم بتنقية SUMO E3 ligase K-bZIP عن طريق استنساخ (كدنا) الخاص ب K-bZIP في ناقل فيروس باكولوبي مزدوج التعبير (انظر جدول المواد) باستخدام علامة حاتمة N-terminal. لقد نجحنا في استخدام علامة ثماني البتيد (يشار إليها في جميع أنحاء البروتوكول باسم vector-tag-K-bZIP).
   ملاحظه: قالب الحمض النووي لاستنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل K-bZIP (PCR) هو نسخ عكسي من الحمض النووي الريبي المعزول من خلايا TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 بعد معالجة الدوكسيسيكلين.
   1. انقل K-bZIP (كدنا) كامل الطول إلى متجه التعبير المزدوج باستخدام مواقع استنساخ CpoI. CPOأقوم بهضم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل و 1 ميكروغرام من متجه التعبير المزدوج عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
   2. افصل واستخرج الحمض النووي المهضوم بعد الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز بنسبة 0.8٪. قم بربط الملحق (K-bZIP) والمتجه بواسطة T4 DNA ligase عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   3. أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي للربط إلى 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة "A" (انظر جدول المواد) في أنبوب 1.5 مل. ضعيها على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، احتضن الأنبوب سعة 1.5 مل في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية وضع الأنبوب على الفور على الجليد لمدة 3 دقائق.
   4. أضف 600 ميكرولتر من مستخلص الخميرة المتوسطة (0.5٪ (وزن / حجم) ، 2٪ (وزن / حجم) التربتون ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مللي ملجمغ₄ ، و 4٪ (وزن / حجم) جلوكوز) في الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق عند 600 × جم.
   5. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات مع 60 ميكرولتر من وسط لوريا-بيرتاني (LB ؛ 1٪ (وزن / حجم) التربتون ، 0.5٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، و 85 ملي كلوريد الصوديوم) وانتشر على ألواح أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان لوحة أجار عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
   6. حدد مستعمرة واحدة للتلقيح في وسط 5 مل رطل يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين وزراعته عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم باستخراج البلازميد ، vector-tag-K-bZIP ، بواسطة مجموعة استخراج البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
2. قم بإنشاء باكميد المؤتلف الذي يؤوي العلامة K-bZIP عن طريق تحويل vector-tag-K-bZIP إلى بكتريا قولونية مختصة خلايا "B" (انظر جدول المواد).
   1. امزج 0.2 ميكروغرام من بلازميد ناقل العلامة K-bZIP و 100 ميكرولتر E مختص. خلايا القولونية "B" في أنبوب 1.5 مل وتوضع على الجليد لمدة 30 دقيقة. احتضان الأنبوب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية وضع الأنبوب على الفور على الجليد لمدة 3 دقائق.
   2. أضف 900 ميكرولتر من وسط SOC في الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع الدوران عند 50 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، خذ 10 ميكرولتر من الوسط ، وأضف 50 ميكرولتر إضافيا من وسط SOC لينتشر على ألواح أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين ، و 7 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين ، و 100 ميكروغرام / مل من ركيزة الجالاكتوزيداز ، و 40 ميكروغرام / مل من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ، واحتضان الألواح لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   3. تلقيح مستعمرة بيضاء واحدة في وسط 5 مل رطل يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، و 7 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
   4. اعزل الحمض النووي الباكميد المؤتلف الذي يحتوي على tag-K-bZIP ، وقم بتحديده كميا وإعادة تعليقه بتركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. قم بتوليد فيروسات باكوتيفية مؤتلفة تعبر عن tag-K-bZIP عن طريق نقل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الباكميد المؤتلف الذي يحتوي على tag-K-bZIP إلى خلايا Sf9 في بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار.
   1. بذرة 2 × 10⁶ خلايا Sf9 (انظر جدول المواد) في 2 مل من Grace's Insect Medium مزودة ب 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 1٪ جنتاميسين في كل بئر من صفيحة 6 آبار ، ثم تحتضن عند 27 درجة مئوية لمدة ساعة.
   2. حافظ على مزرعة طور لوغاريتمية لخلايا Sf9 في وسط الحشرات من Grace المزود ب 10٪ FBS و 1٪ جنتاميسين و 1٪ منظف C (انظر جدول المواد) عند 27 درجة مئوية في التعليق المداري عند 140 دورة في الدقيقة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والتلوين الأزرق المثقب. يجب أن تتجاوز صلاحية الخلية 95٪. حافظ على الخلايا باستخدام نسبة زراعة فرعية تبلغ 1: 3 كل 2-3 أيام (الحد الأدنى من الكثافة ~ 0.5 × 10⁶ خلايا / مل).
   3. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي البكميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) و 98 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 2 مل. ثم أضف كاشف تعداء 4 ميكرولتر (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب واخلطه جيدا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   4. أضف خليط التعداء هذا (104 ميكرولتر) في كل بئر ، واحتضانه عند 27 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
   5. قم بإزالة الوسائط المستنفدة بشفط لطيف ، واستبدلها ب 2 مل من Grace's Insect Medium الطازج المزود بنسبة 10٪ FBS و 1٪ جنتاميسين. تلتصق خلايا Sf9 بشكل فضفاض بسطح اللوحة ولن تنزعج من الشفط اللطيف.
4. جمع الفيروس العصبي المؤتلف بعد التعدي وتضخيم الفيروس الباكلي للحصول على مخزونات عالية العيار (P1) لمزيد من التجارب.
   بعد
   1. 72 ساعة من تغيير الوسط ، اكشط خلايا Sf9 باستخدام رافع الخلايا المعقم ، واجمع المادة الطافية من كل بئر فردي في أنبوب سعة 1.5 مل ، ودوامة لمدة 10 ثوان.
   2. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق عند 150 × جم. اجمع المادة الطافية مثل الفيروس الباكولو P0 ولقب في أنابيب سعة 1.5 مل (1 مل من الفيروس العصبي في كل أنبوب). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
   3. بذور 1 × 10⁷ خلايا Sf9 في 10 مل Grace's Insect Medium مزودة ب 10٪ FBS و 1٪ جنتاميسين في طبق بتري مقاس 10 سم وتحتضن عند 27 درجة مئوية لمدة ساعة.
   4. لتضخيم الفيروسات الباكولوجية المؤتلفة التي تعبر عن tag-K-bZIP ، أضف 0.5 مل P0 الفيروس العصبي إلى خلايا Sf9 المصنفة واحتضانها عند 27 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
   5. اجمع المادة الطافية على شكل فيروس باكوتي P1 في أنبوب سعة 15 مل وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

< p class = "jove_title" >2. تنقية K-bZIP

1. حافظ على مزرعة طور السجل لخلايا Sf9 في وسط الحشرات من Grace المزود ب 10٪ FBS و 1٪ جنتاميسين و 1٪ منظف C عند 27 درجة مئوية في التعليق المداري عند 140 دورة في الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 1.3.2.
2. في يوم التنبيغ ، أضف 1 مل من المادة الطافية المحتوية على فيروس الباكولو (P1) إلى 250 مل من خلايا Sf9 بكثافة 2 × 10⁶ خلايا / مل.
3. احتضان خلايا Sf9 لمدة 72 ساعة عند 27 درجة مئوية على شاكر مداري مع اهتزاز 140 دورة في الدقيقة ، ثم جمعها عن طريق الطرد المركزي عند 2,740 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإزالة كريات الخلايا الطافية والليز في محلول تحلل 10 مل (20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.9 ، 0.5 M كلوريد الصوديوم ، 1٪ منظف A (انظر جدول المواد) ، 2٪ جلسرين ، كوكتيل مثبط للبروتين) وقم بتدويرها عند 50 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط تعليق عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. تحلل خلايا الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة لجمع المادة الطافية.
6. لتنقية tag-K-bZIP ، قم باحتضان محللات الخلية (10 مل) ب 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الموسوم بالأجسام المضادة في أنابيب البولي بروبيلين سعة 14 مل ، وقم بالتدوير عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية باستخدام خلاط تعليق. بعد التقاط البروتين ، قم بتكبيل الخرزات عند الطرد المركزي 800 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة معظم المادة الطافية ، وأعد تعليق الخرزات في الحجم المتبقي البالغ حوالي 1 مل ، وانقلها إلى أنبوب 1.5 مل للغسيل.
7. اغسل البروتين الملتقط عن طريق وضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات على حامل مغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن تلتصق الخرزات المغناطيسية تماما بجانب الأنبوب.
8. اغسل الخرزات بمحلول التحلل أربع مرات.
   1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل إلى أنابيب سعة 1.5 مل ، واقلب الأنابيب 10 مرات. ضع الأنبوب سعة 1.5 مل على حامل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية كما هو موضح في 2.7.
   2. كرر الخطوة السابقة 3 مرات أخرى.
9. اغسل الخرزات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة.
   1. أضف 1 مل من PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 8 ملي سيوم₂HPO₄ ، 1.5 ملي مولار KH₂PO₄) في أنابيب 1.5 مل ، واقلب الأنابيب 10 مرات.
   2. ضع الأنبوب سعة 1.5 مل على حامل مغناطيسي ثم قم بإزالة المادة الطافية.
10. بروتين Elute tag-K-bZIP من الخرز المغناطيسي الموسوم بالأجسام المضادة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 150 ميكروغرام / مل ثماني البتيد المخفف في PBS في أنبوب 1.5 مل. قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 50 دورة في الدقيقة بواسطة خلاط تعليق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واجمع المادة الطافية المحتوية على K-bZIP في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل.
11. قم بتحليل 1-5 ميكرولتر من بروتين TAG-K-bZIP المنقى بواسطة SDS-PAGE متبوعا بتلطيخ Coomassie الأزرق. قم بتحميل عينات 2 ميكروغرام و 1 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام من ألبومين مصل الأبقار (BSA) على نفس الجل واستخدمها للقياس الكمي باستخدام برنامج معالجة الصور ، مثل ImageJ. تقدير تركيز K-bZIP بالمقارنة مع معايير BSA.
12. أصبح K-bZIP المنقى جاهزا الآن للاستخدام في كل اختبار SUMOylation. قم بتخفيف K-bZIP في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينه في كميات صغيرة عند -80 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. فحص SUMOylation

1. أضف 3 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر من العلامة المنقاة-K-bZIP إلى المزيج الرئيسي لكل تفاعل SUMOylation في المختبر. تحتوي المكونات الموجودة في المزيج الرئيسي على 1 ميكرولتر من البروتين ، و 1x SUMOylation buffer ، و 0.5 ميكرولتر من بروتين p53 (0.5 مجم / مل) ، و 25 نانومتر من إنزيم تنشيط E1 (مخزون: 1 ميكرومتر) ، و 50 نانومتر من الإنزيم المترافق E2 (مخزون: 10 ميكرومتر) ، و 250 نانومتر لكل من ببتيدات سومو (SUMO-1 ، SUMO-2 ، أو SUMO-3 ؛ مخزون: 5 ميكرومتر) إلى حجم نهائي قدره 17 ميكرولتر.
2. امزج المحتويات برفق واحتضن التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. أوقف التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من 2x SDS-PAGE المخزن المؤقت للتحميل (100 ملي مولار Tris-HCL pH 6.8 ، 4٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 0.2٪ (وزن / حجم) بروموفينول أزرق ، 20٪ (حجم / حجم) جلسرين ، و 200 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول) وقم بتغيير طبيعة العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. افصل العينات على SDS-PAGE ، وانقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء PVDF باستخدام جهاز نقل كهربائي شبه جاف ، وقم بتحليله بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد ل p53.
   1. قم بإعداد جهاز الجل وقم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة في آبار الهلام.
   2. قم بتشغيل الجل بنسبة 10٪ في تيار ثابت عند 80 فولت لمدة 120 دقيقة تقريبا (حتى يصل شريط الصبغة إلى قاع الجل). بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة.
   3. افصل جهاز الجل وأشرطة الجل لإخراج الجل ، وقم بتعويم الجل في مخزن مؤقت للنقل شبه الجاف (48 ملي مولار Tris-HCl ، 39 ملي مولار جلايسين ، 20٪ ميثانول) لمدة 5 دقائق.
   4. خذ وعاءا آخر وانقع غشاء PVDF في الميثانول لمدة 1 دقيقة. ثم أخرج PVDF من الميثانول وضعه في مخزن مؤقت للنقل شبه الجاف. حرك الغشاء برفق لمدة 5 دقائق.
   5. قم بإزالة غطاء الأمان للجهاز الكهربائي شبه الجاف.
   6. قم بإعداد ورق الترشيح المبلل مسبقا ، وقم بإعداد شطيرة جل على الأنود البلاتيني السفلي على النحو التالي: ورق الترشيح ، وغشاء PVDF ، والهلام ، وورق الترشيح.
   7. قم بتأمين لوحة الكاثود وغطاء الأمان ، ثم قم بتشغيل اللطخة عند تيار ثابت 15 فولت لمدة 90 دقيقة. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة ، وافصل الجهاز شبه الجاف ، وأخرج غشاء PVDF.
   8. قم بحظر غشاء PVDF مع مخزن مؤقت مانع (5٪ حليب خالي الدسم في محلول TBST (137 ملي NaCl2 ، 20 ملي Tris-HCl ، 0.1٪ منظف B (انظر جدول المواد) ، درجة الحموضة 7.6)) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز 30 دورة في الدقيقة بواسطة شاكر مداري.
   9. قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد ل p53 مخفف (1: 1,000) في مانع المخزن المؤقت لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز 30 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط تعليق.
   10. أخرج غشاء PVDF في وعاء وضعه في TBST. اشطف غشاء PVDF باستخدام TBST مرتين أخريين.
   11. انقع غشاء PVDF في TBST لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز 45 دورة في الدقيقة بواسطة شاكر مداري.
   12. قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد للأرانب مقترن ببيروكسيداز الفجل (HRP) المخفف (1: 4,000) في مانع المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز 30 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط تعليق.
   13. اغسل غشاء PVDF باستخدام TBST 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 3.4.10.
   14. انقع غشاء PVDF في TBST لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز 45 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط التعليق. قم بإزالة TBST وأضف PBS للحفاظ على غشاء PVDF عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 ساعة.
   15. امزج كاشف الركيزة الكيميائية المحسنة (ركيزة ECL) 1 و 2 (1: 1) (انظر جدول المواد). قم بإزالة غشاء PVDF من PBS ، وامسح لفترة وجيزة بمنشفة ورقية أو ممسحة خفيفة لامتصاص الرطوبة الزائدة ، وأضف على الفور 400 ميكرولتر من كاشف ECL إلى سطح كل غشاء لمدة 3-5 دقائق. قم بإزالة كاشف ECL الزائد عن طريق النشاف لفترة وجيزة ، لكن لا تدع الغشاء يجف تماما.
   16. كشف اللطخة باستخدام نظام تصوير اللمعان أو فيلم التصوير الشعاعي الذاتي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات pFastBac إنفيتروجين 10359-016 ناقل الفيروس العصبي مزدوج التعبير متجه pCR2.1-TOPO إنفيتروجين ناقلات منتج PCR الخلية المختصة بكتريا قولونية DH5α الخميرة الحيوية FYE678-80VL الخلايا الإشريكية القولونية المختصة أ الإشريكية القولونية DH10Bac إنفيتروجين 10359-016 الخلايا الإشريكية القولونية المختصة ب FugeneHD روش 4709705001 كاشف النفقة أوبتي-ميم جيبكو 31985062 وسائط مصل مخفضة T4 Ligase نيو إنجلاند بيولابز M0202S CpoI (RsrII) الترمو: العلمية ER0741 بلو غال الترمو: العلمية ب 1690 الركيزة galactosidase IPTG سيجما ألدريتش I6758-1G وسط الحشرات جريس جيبكو 11605094 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10082147 الجنتاميسين ثيرمو فيشر 15750060 أمبيسلين سيجما ألدريتش أ 9393-25 جي كاناميسين سيجما ألدريتش K0254-20 مل الجنتاميسين جيبكو 15710-064 التتراسيكلين سيجما ألدريتش 87128-25 جرام مرق LB ميرك 1.10285.0500 هيبس سيجما ألدريتش H4034-100G كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S9888-5 كجم كيه سي إل ميرك 1.04936.1000 نا₂HPO₄ سيجما ألدريتش إس 5136-500 جرام KH₂PO₄ جي تي بيكر 3246-01 كبريتات دوديسيل الصوديوم ميرك 1.13760.1000 β ميركابتو إيثانول بيو راد 161-0710 TRIS (قاعدة) جي تي بيكر 4109-06 حليب خالي الدسم فونتيرا الجلسرين جي تي بيكر 2136-01 تريتون X-100 أمريسكو 0694-1 لتر المنظفات أ توين 20 أمريسكو 0777-500 مل المنظفات ب محلول بولوكسامير 188 سيجما ألدريتش P5556-100 مل المنظفات ج قرص كوكتيل مثبط للبروتياز روش 04 693 132 001 3x علم الببتيد سيغما F4799 الخرز المغناطيسي المضاد ل FLAG m2 سيجما ألدريتش M8823 الخرز المغناطيسي الموسوم بالأجسام المضادة مجموعة SUMOlink SUMO-1 الفكرة النشطة 40120 بروتوكول SUMOylation القياسي مجموعة SUMOlink SUMO-2/3 الفكرة النشطة 40220 بروتوكول SUMOylation القياسي طقم استخراج جل QIAquick كياجين هاتف: 28704 كيت QIAGEN البلازميد الصغير كياجين هاتف: 12123 طقم استخراج البلازميد أنابيب البولي بروبلين صقر 352059 طبق بتري صقر 351029 رافع الخلايا كورنينج CNG3008 نصيحة التحميل سورنسون للعلوم البيولوجية هاتف: 28480 PVDF بيركين إلمر NEF1002 نشاف ورق الترشيح بيو راد 1703932 جهاز هلام بلاطة صغيرة (Bio-Rad Mini Protean Cell II) بيو راد 1658001 EDU خلية نقل كهربائية شبه جافة Trans-Blot SD بيو راد 1703940 بيرس ECL النشاف الغربي الحراريه 32106 كاشف ECL خلاط التعليق شركة Digisystem لأدوات المختبر SM-3000 شاكر مداري شركة كانسين للأدوات نظام التشغيل701 طابعة ImageQuant LAS 4000 جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 28955810 تصوير الجزيئات الحيوية جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 28955810 Sf9 الترمو: العلمية ب 82501 الأجسام المضادة ل P53 إشارات الخلية #9282 الأجسام المضادة للأرانب جنرال إلكتريك للرعاية الصحية NA934-1 مل