$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير الكاشف
- قم بإعداد وسيط DMEM منخفض التألق للمقايسات باستخدام قارئ مضان ميكروبليت. مزيج 25 ملي جلوكوز ، 0.4 ملي جلايسين ، 0.4 ملي أرجينين ، 0.2 ملي سيستين ، 4.0 ملي جلوتامين ، 0.2 ملي هيستيدين ، 0.8 ملي إيزولوسين ، 0.8 ملي ليوسين ، 0.8 ملي ليسين ، 0.2 ملي ميثيونين ، 0.4 ملي فينيل ألانين ، 0.4 ملي سيرين ، 0.8 ملي ثريونين ، 0.078 ملي تريبتوفان ، 0.4 ملي تيروزين ، 0.8 ملي فالين ، 1.8 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 0.81 ملي ملي مجم4 ، 5.33 ملي كلوريد الصوديوم ، 44.0 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، 110 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.9 ملي هيدروكسيدهيدروكسيد 2PO4. اضبط درجة الحموضة في المحلول باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم على الرقم الهيدروجيني 7.4. تعقيم الوسط من خلال الترشيح.
ملاحظه: يحتوي هذا الوسيط على مكونات من وسط DMEM القياسي مع نسبة عالية من الجلوكوز باستثناء حذف Fe (NO3) 3 والفيتامينات والفينول الأحمر. يتداخل الفينول الأحمر والريبوفلافين والبيريدوكسال في وسط ثقافة DMEM العادي بشكل كبير مع الكشف عن إشارة التألق. يعد وسط الثقافة بدون هذه المكونات أمرا بالغ الأهمية لتصوير GFP للخلايا الحية الناجحة. يكون الوسط مستقرا لمدة 12 شهرا عند تخزينه في الثلاجة.
< p class = "jove_title" >2. فحص التحلل في الوقت الحقيقي ل NLS-luciferase-GFP باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية
- قم بزرع ما يقرب من 1 × 104 خلايا هيلا في صفائح زراعة أنسجة سوداء ذات 96 بئرا ذات قاع شفاف. بعد زراعة O / N ، يتم الوصول إلى التقاء 50-70٪ في وقت التعدي.
ملاحظة: يتم زرع 60 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على خلايا HeLa معلقة تماما مباشرة في كل بئر. لا تضيف وسطا إضافيا أو صفيحة صخرية ذهابا وإيابا بعد البذر ، وإلا فقد يتم توزيع الخلايا بشكل غير متساو.
- قم بعمل خلايا HeLa الشفافة مع 0.05-0.1 ميكروغرام من بلازميد NLS-luciferase-GFP / pRK5 في كل بئر باستخدام كاشف التعداء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اصنع مزيجا رئيسيا من التعداء يحتوي على الحمض النووي وكاشف التعداء وقم بتقسيسه لكل بئر. لا يتم نقل ثلاثة آبار بها خلايا بالحمض النووي ، والذي يعمل كعنصر تحكم في إشارة مضان الخلفية لكل حالة علاجية.
ملاحظه: طريقة بديلة لتقليل تباين التعدي هي نقل الخلايا قبل البذر. ومع ذلك ، فإن جزءا كبيرا من الخلايا المنقولة ببروتينات غير مطوية تفشل في الارتباط أو إظهار انخفاض الجدوى باستخدام هذه الطريقة. من المحتمل أن بعض الخلايا قد لا تتحمل الإجهاد الناجم عن هضم التربسين عند التعبير عن البروتينات السامة غير المطوية. نتيجة لذلك ، يتم تقليل إشارة الفلورسنت الإجمالية بشكل كبير.
- بعد 20-24 ساعة من التعدي ، افحص الخلايا الحية تحت مجهر فلوري مقلوب للتعبير عن GFP بطول موجة إثارة 450-490 نانومتر.
- قم بإزالة الوسيط عن طريق الشفط بالفراغ. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر 1x PBS إلى كل بئر ثم استنشقها لإزالة الكمية المتبقية من وسط DMEM.
- أضف 60 ميكرولتر من وسط DMEM منخفض التألق مع 5٪ FBS و 50 ميكروغرام / مل CHX. لفحص التحلل البروتيزومي ، قم بتضمين مثبط البروتيازوم الإضافي MG132 (10 ميكرومتر) في مجموعة واحدة من العينات. تعيين ثلاث نسخ من الآبار لكل علاج / حالة.
ملاحظه: يتم تضمين علاج MG132 كضوابط لتدهور البروتيزومات لأنه من الأهمية بمكان استبعاد العوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب انخفاض إشارة التألق ، بما في ذلك موت الخلايا وإخماد التألق.
- قم بقياس إشارة التألق ل GFP على الفور على قارئ لوحة الفلورسنت بعد إضافة CHX.
ملاحظه: يتم عرض إعدادات قياس البرامج في الجدول 1.
- اقرأ الطبق كل ساعة لمدة تصل إلى 8-10 ساعات. بعد القراءة ، أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا.
- تصدير البيانات كملف جدول بيانات. استخدم القيمة المتوسطة للقراءات المتعددة لكل بئر بالإضافة إلى شدة التألق. تطبيع قيم كل نقطة بيانات إلى متوسط قيم الوقت 0 في المجموعات المعنية. ارسم شدة التألق الطبيعية بمرور الوقت كما هو موضح في الشكل 1 أ و 1 ب ، والشكل 2 ، اللوحات اليمنى.
- إجراء تحليل إحصائي لمعدلات التحلل بين حالتين باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع مقاييس متكررة.
ملاحظه: في هذا التحليل ، "شدة التألق" هي المتغير التابع بينما "ظروف العلاج" و "الوقت" هما العاملان. بدلا من مقارنة البيانات في النقاط الزمنية الفردية ، يحلل ANOVA ثنائي الاتجاه مع المقاييس المتكررة الفرق بين مجموعتي العلاج على مدار الدورة الزمنية بأكملها.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1: إعدادات القياس على قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية.
ملف تعريف اللوحة
GRE96fb
وضع القياس
قاع شدة التألق
الطول الموجي
الطول الموجي للإثارة
485 نانومتر
عرض النطاق الترددي للإثارة
9 نانومتر
الطول الموجي للانبعاث
535 نانومتر
عرض النطاق الترددي للبث
20 نانومتر
عدد الومضات
5
كسب
يدوي 200
وقت التكامل
20 ميكرو ثانية
قراءات متعددة لكل بئر
نوع
دائرة (مملوءة)
حجم
5×5
حد
400 ميكرومتر
