مقايسة المثامرة في المختبر: طريقة لتقييم تأثير الأسموليتات على ثبات البكتيريا

الملخص

المصدر: Karki، P. et al. فحص عالي الإنتاجية للمركبات الكيميائية لتوضيح آثارها على ثبات البكتيريا. J. Vis. إكسب. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة لتقييم تأثير الأسموليتات على تكوين الثببات البكتيرية. تتعرض الخلايا البكتيرية أولا للأوسموليتات للحث على الإجهاد التناضحي ، مما يؤدي إلى تكوين المثابرة ، ثم تعالج بالمضادات الحيوية لتعداد المثابرات.

البروتوكول

فئة

1. تحضير وسط النمو ومحلول الفلوكساسين ومخزون خلايا الإشريكية القولونية

1. وسط لوريا بيرتاني العادي: أضف 10 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة في الماء منزوع الأيونات (DI). تعقيم الوسط عن طريق التعقيم.
2. ألواح أجار LB: أضف 10 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 15 جم / لتر من أجار في ماء DI وقم بتعقيم الوسط عن طريق التعقيم. عند درجة الحرارة المطلوبة (~ 55 درجة مئوية) ، صب ~ 30 مل من وسط أجار في ألواح مربعة (10 × 10 سم). جفف الأطباق وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية.
3. وسط LB المعدل: أضف 10 جم / لتر من التربتون و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة في ماء DI. تعقيم الوسط عن طريق التعقيم.
4. وسط LB المعدل بما في ذلك الأسموليت: امزج 2x وسط LB معدل مع محلول osmolyte 2x بأحجام متساوية. لتحضير 2x وسط LB معدل ، أضف 20 جم / لتر من التربتون و 10 جم / لتر من مستخلص الخميرة في ماء DI وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم. لتحضير محلول الأسموليت 2x ، قم بإذابة الأسموليت محل الاهتمام (كمية 2x) في ماء DI ، ثم قم بتصفية تعقيم المحلول.
   ملاحظه: يمكن تحديد الأسموليت المورد للاهتمام وتركيزاته من فحوصات فحص المصفوفات الدقيقة للنمط الظاهري (انظر البروتوكول 4). ومع ذلك ، يمكن تعديل الأسموليت المختبر وتركيز 2x المرتبط به اعتمادا على طبيعة البحث. على سبيل المثال ، لدراسة تأثير 1 ملي كلوريد الصوديوم ، سيكون محلول الأسموليت 2x محلول كلوريد الصوديوم 2 مل.
5. محلول مخزون أوفلوكساسين (5 مجم / مل): أضف 5 ملغ من ملح أوفلوكساسين (OFX) في 1 مل من ماء DI. أضف 10 ميكرولتر من 10 M هيدروكسيد الصوديوم لزيادة قابلية ذوبان OFX في الماء ، ثم قم بتصفية تعقيم المحلول. تحضير الحصص وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية
   ملاحظه: أوفلوكساسين هو مضاد حيوي للكينولون يستخدم على نطاق واسع لكل من الخلايا البكتيرية النامية وغير النامية14،21. الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) ل OFX للإشريكية القولونية MG1655 خلايا في حدود 0.039-0.078 ميكروغرام / مل. لاحظ أيضا أن المضادات الحيوية الأخرى مثل الأمبيسلين والكاناميسين شائعة الاستخدام في الأبحاث المستمرة. يعتمد اختيار المضادات الحيوية على طبيعة الدراسة.
6. بكتريا قولونية MG1655 مخزون الخلايا: تلقيح 2 مل من وسط LB العادي بمستعمرة واحدة في أنبوب اختبار سعة 14 مل (مغطى بالغطاء) وزرع الخلايا في شاكر مداري عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى المرحلة الثابتة ، امزج 500 ميكرولتر من مزرعة الخلية مع 500 ميكرولتر من 50٪ جلسرين (معقم) في قارورة مبردة وخزنها عند -80 درجة مئوية.

2. تكاثر الخلايا للقضاء على المثابرات الموجودة مسبقا

1. لتحضير مزرعة بين عشية وضحاها ، اكشط كمية صغيرة من الخلايا من مخزون الخلايا المجمدة بطرف ماصة معقمة (لا تقم بإذابة مخزون خلايا الجلسرين) ، وقم بتلقيح الخلايا في 2 مل من وسط LB المعدل في أنبوب اختبار مغطى بسعة 14 مل. استزراع الخلايا في شاكر مداري عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
2. التكاثر الأول
   1. بعد 12 ساعة ، انقل 250 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 25 مل من وسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة سعة 250 مل مغطاة بورق الألمنيوم المعقم.
   2. قم بزراعة الخلايا في شاكر مداري عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى تصل الخلايا إلى المرحلة الأسية المتوسطة (OD₆₀₀ = 0.5).
   3. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) باستخدام قارئ صفيحة دقيقة كل 30 دقيقة.
3. التكاثر الثاني
   1. عند OD₆₀₀ = 0.5 ، قم بتخفيف 250 ميكرولتر من زراعة الخلايا من القارورة الأولى إلى 25 مل من وسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة سعة 250 مل.
   2. قم بزراعة ثقافة الخلية الثانية في شاكر مداري عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى OD₆₀₀ = 0.5.
   3. قياس الكثافة الضوئية كل 30 دقيقة
      ملاحظه: قد تحتوي الثقافة الليلية على كمية كبيرة من الخلايا الثابتة. يمكن استخدام طريقة دورة التخفيف / النمو الموضحة أعلاه للتخلص من هذه الثباتات الموجودة مسبقا قبل نقل الخلايا إلى المصفوفات الدقيقة. يمكن التحقق من صحة القضاء عليها عن طريق القياس الكمي للمستويات المستمرة للمزارع الليلية باستخدام الفحص الموصوف في البروتوكول 3.

3. التحقق من صحة التخلص من الخلايا الثابتة الموجودة مسبقا

1. بعد التكاثر الثاني (انظر الخطوة 2.3) ، قم بتخفيف 250 ميكرولتر من مزرعة الخلية (OD₆₀₀ = 0.5) في 25 مل من وسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة سعة 250 مل.
   ملاحظه: بالنسبة للعناصر الضابطة، قم بتخفيف 250 ميكرولتر من المزرعة الليلية (انظر الخطوة 2.1) في 25 مل من وسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة سعة 250 مل. قبل نقل الخلايا إلى القارورة ، يجب تعديل كثافة الخلية للثقافة الليلية في وسط LB معدل جديد للحصول على OD₆₀₀ = 0.5.
2. أضف 25 ميكرولتر من محلول مخزون OFX (5 مجم / مل) إلى تعليق الخلية وقم بهز القارورة برفق لجعل ثقافة الفحص متجانسة. التركيز النهائي ل OFX هو 5 ميكروغرام / مل في ثقافة الفحص.
3. احتضان ثقافة الفحص في شاكر مداري عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
4. في كل ساعة أثناء العلاج (بما في ذلك 0 ساعة ، النقطة الزمنية قبل إضافة OFX إلى ثقافة الفحص) ، انقل 1 مل من ثقافة الفحص من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
5. جهاز الطرد المركزي ثقافة الفحص في أنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 17,000 × جم لمدة 3 دقائق.
6. قم بإزالة 950 ميكرولتر من المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
7. أضف 950 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
8. كرر خطوات الغسيل 3.5-3.7 لمدة 3 مرات في المجموع حتى يصبح تركيز المضادات الحيوية أقل من الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC).
9. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول PBS ، مما ينتج عنه عينة مركزة 10x.
10. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وقم بتخفيفه بشكل متسلسل ست مرات في 90 ميكرولتر من محلول PBS باستخدام صفيحة سفلية مستديرة سعة 96 بئرا.
11. ضع 10 ميكرولتر من معلقات الخلايا المخففة على ألواح أجار طازجة خالية من المضادات الحيوية. لزيادة حد الكشف ، قم بوضع 90 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية على لوحة أجار جديدة.
12. احتضان ألواح الأجار عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، ثم عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs). حساب معدلات التخفيف أثناء حساب العدد الإجمالي ل CFUs في 1 مل من ثقافة الفحص. يتم إنشاء منحنيات القتل عن طريق رسم قيم CFU اللوغاريتمية فيما يتعلق بمدة العلاج بالمضادات الحيوية.
    ملاحظه: يكفي علاج OFX لمدة 6 ساعات للحصول على منحنى قتل ثنائي الطور لخلايا الإشريكية القولونية. يجب أن يكون المستوى المستمر للخلايا المنتشرة (كما تم قياسه بواسطة عدد CFU عند 6 ساعات) أقل بكثير من مستوى الثقافة الليلية. يمكن تنفيذ الإجراءات الموضحة في البروتوكول 2 و 3 باستخدام LB العادي اعتمادا على تصميم البحث.

فئة

4. فحوصات لوحة المصفوفة الدقيقة

1. تحضير مزارع الخلايا الدقيقة
   1. انقل 250 ميكرولتر من خلايا الطور الأسي إلى 25 مل من وسط LB المعدل الطازج في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. امزج معلق الخلية برفق لجعله متجانسا.
      ملاحظه: يتم الحصول على خلايا الطور الأسي (OD₆₀₀ = 0.5) من خطوة الانتشار الثانية (انظر الخطوة 2.3).
   2. انقل معلق الخلية المخفف إلى خزان معقم سعة 50 مل.
   3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 150 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من المصفوفة الدقيقة، أي صفيحة ذات 96 بئرا تحتوي على أسموليتات مختلفة.
      ملاحظه: تعمل الآبار التي لا تحتوي على الأسموليتات كضوابط.
   4. قم بتغطية المصفوفة الدقيقة بغشاء مانع للتسرب منفذ للغاز.
   5. احتضان اللوحة في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة < br / > ملاحظه: في هذه التجارب ، تم استخدام اللوحات المتاحة تجاريا ، مثل المصفوفات الدقيقة للنمط الظاهري (PM-9 و PM-10) التي تشمل مجموعة واسعة من الأسموليتات ومخازن الأس الهيدروجيني والمواد الكيميائية الأخرى في حالة جافة بتركيزات مختلفة. هذه المصفوفات الدقيقة موجودة في نصف مساحة 96 تنسيقات لوحة بئر. يجب تعديل أحجام الثقافة اعتمادا على نوع الألواح المستخدمة. يمكن أيضا إنشاء المصفوفات الدقيقة يدويا.
2. التحضير اليدوي للوحات المصفوفات الدقيقة
   1. انقل 75 ميكرولتر من محاليل الأسموليت 2x إلى آبار صفيحة بئر 96 بئر نصف مساحة.
   2. نقل 500 ميكرولتر من خلايا الطور الأسي إلى 25 مل من وسط LB المعدل 2x في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. امزج معلق الخلية برفق لجعله متجانسا.
      ملاحظه: تم تعديل معدل التلقيح ليكون متسقا مع بروتوكول فحص المصفوفات الدقيقة الموصوف في 4.1.
   3. أضف 75 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة نصف المنطقة المكونة من 96 بئر تحتوي على 2x محاليل osmolyte.
   4. احتضان اللوحة في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
3. تحضير لوحات الفحص الثابتة
   1. قم بإعداد 25 مل من وسط LB المعدل الذي يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من OFX في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ونقل هذا الوسيط إلى خزان معقم.
   2. انقل 190 ميكرولتر من وسط LB المعدل مع OFX من الخزان إلى كل بئر من صفيحة بئر عامة مسطحة القاع 96 (لوحة فحص ثابتة) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   3. قم بإزالة المصفوفة الدقيقة من الخلاط (بعد الزراعة لمدة 24 ساعة) وانقل 10 ميكرولتر من مزارع الخلايا من المصفوفة الدقيقة إلى آبار لوحة الفحص المستمر ، التي تحتوي على وسط LB معدل مع OFX.
   4. خذ 10 ميكرولتر من معلقات الخلايا من لوحة الفحص الثابتة وقم بتخفيفها بشكل متسلسل ثلاث مرات في 290 ميكرولتر من محلول PBS باستخدام صفيحة بئر 96 مستديرة القاع وماصة متعددة القنوات.
   5. بعد التخفيف التسلسلي، ضع 10 ميكرولتر من جميع معلقات الخلايا المخففة تسلسليا على ألواح أجار طازجة خالية من المضادات الحيوية باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   6. احتضان لوحة الفحص المتواصل (المحضرة في الخطوة 4.3.3) في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات بعد تغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب منفذ للغاز.
   7. بعد 6 ساعات من الحضانة في شاكر ، أخرج لوحة الفحص المستمر وكرر الخطوات 4.3.4-4.3.5.
   8. احتضان ألواح أجار لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم عد CFUs. تتيح مستويات CFU قبل وبعد العلاج بالمضادات الحيوية 6 ساعات حساب الكسر المستمر في كل بئر. يساعد عدد CFU قبل علاج OFX أيضا في تقييم آثار الأسموليتات وعلى بكتريا قولونية الجدوى.

المواد