فحص الشلل القائم على مراسل الفلورسنت: تقنية لتقييم التكوين التدريجي المرتبط بالعمر لمراسل الفلورسنت متعدد الجلوتامين والشلل المرتبط به في Caenorhabditis elegans

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Lazaro-Pena ، M. I. et al. تحديد الانخفاض البروتيني الخاص بالأنسجة في Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو فحصا قائما على التصوير في الجسم الحي لتحديد انخفاض البروتين بسبب الشيخوخة. يستخدم الاختبار Caenorhabditis elegans الذي يعبر عن بروتين اندماج بولي جلوتامين YFP في عضلات جدار الجسم لقياس التراكم المرتبط بالعمر للبولي جلوتامين وتحريض السمية البروتينية ، مما يؤدي إلى الشلل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. قياس انخفاض البروتينات في الأنسجة العضلية باستخدام التي تعبر عن البولي جلوتامين

ملاحظة: يمكن استخدام طريقتين لتحديد انخفاض البروتين في خلايا العضلات: تصوير تكوين مجاميع البروتين أثناء الشيخوخة (1.1) وقياس السمية البروتينية التي تسببها هذه المجاميع مع تقدم العمر من خلال ظهور الشلل (1.2).

1. تصوير تكوين ركام البولي جلوتامين في العضلات أثناء الشيخوخة
   ملاحظه: يتم تصوير التقدم المعتمد على العمر لتراكم البروتين في خلايا العضلات باستخدام تكرارات بولي جلوتامين (polyQ) المدمجة في بروتين فلوري أصفر (YFP). يحدد هذا البروتوكول استخدام سلالة AM140 rmIs132 [unc-54p::Q35::YFP] ، ولكن يمكن أيضا استخدام سلالات متغيرة أخرى من البولي جلوتامين. يتم التعبير عن الجين المعدل polyQ:: YFP في العضلات باستخدام المحفز الخاص بالعضلات unc-54. يتم تصور المتزامنة unc-54p: :p olyQ:: YFP التي تعبر عن في اليوم 1 و 2 و 3 و 4 من مرحلة البلوغ. لتصور مجاميع unc-54p: :p olyQ::YFP ، استخدم مجهرا مركبا مجهزا للمضان أو مجهر تشريح الفلورسنت. يتوفر AM140 من مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) على: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
   1. في أيام التصوير (اليوم 1 و 2 و 3 و 4 من مرحلة البلوغ) ، اختر 20 وقم بتثبيتها على إعداد منزلق مجهري مع وسادة أغاروز 3٪ وقطرة 5 ميكرولتر من أزيد الصوديوم 10 ملي مولار (مخفف في المخزن المؤقت M9).
   2. بعد تثبيت جميع بواسطة أزيد الصوديوم (~ 5 دقائق) ، قم بتصوير أجسام بالكامل باستخدام عدسة تكبير 10x (الشكل 1 أ). للتصوير ، استخدم مرشح FITC ونفس التعرض لكل. تجاهل الشرائح بعد التصوير.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن أيضا قياس بؤر YFP مباشرة على الألواح ، ولكن يجب تثبيط الحركة عن طريق تطبيق تيار من ثاني أكسيد الكربون على اللوحة أثناء التسجيل. هذه الطريقة البديلة هي الأنسب عند فحص عدد كبير من الحالات.
   3. بعد الحصول على الصور ، احسب عدد البؤر في عضلات جدار الجسم للحيوان بأكمله. البؤر هي إشارات أكثر إشراقا متقطعة يمكن تمييزها عن الإشارة القابلة للذوبان في الخلفية.
   4. ارسم تطور تراكم بؤر YFP من الأيام 1 و 2 و 3 و 4. ارسم رسما بيانيا XY حيث يمثل X أيام البلوغ ويمثل Y عدد unc-54p: :p olyQ:: بؤر YFP (الشكل 1 ب). تتم مقارنة عدد البؤر في الحالة التجريبية (على سبيل المثال ، تقليل تنظيم الجينات أو الإفراط في التعبير) بحيوانات التحكم. إجراء التحليل الإحصائي بين المجموعات في كل نقطة زمنية لوحظت لكل تجربة.
      1. عند مقارنة عدد البؤر لحالتين فقط ، قم بإجراء اختبار t عينة مستقلة في كل نقطة زمنية.
      2. عند مقارنة عدد البؤر لأكثر من شرطين ، قم بإجراء تحليل ANOVA شامل أحادي الاتجاه لكل نقطة زمنية ، بما في ذلك البيانات الخاصة بجميع الظروف في تلك النقطة الزمنية. إذا كان ANOVA الشامل ينتج عنه قيمة p كبيرة (على سبيل المثال ، p < 0.005) ، فقم بإجراء تحليل لاحق مع اختبارات t المستقلة الزوجية لتحديد الظروف المحددة التي تم اكتشاف اختلاف كبير بينها في البؤر (على سبيل المثال ، بالنسبة للمجموعات A و B و C قارن A & B و A و C و B & C).

فئة

2. قياس معدلات الشلل الحيواني كبديل لسمية البولي جلوتامين في خلايا العضلات

ملاحظة: تؤدي الزيادة المعتمدة على العمر في مجاميع polyQ في العضلات إلى انخفاض الوظيفة العضلية التي تدفع الحركة. يمكن تحديد هذا العيب في الحركة عن طريق قياس المعدل التدريجي للشلل في التي تعبر عن polyQ. بالنسبة لمقايسة الشلل ، يتم تسجيل المتزامنة unc-54p: :p olyQ::YFP التي تعبر عن في اليوم 3 و 5 و 7 و 9 من مرحلة البلوغ. أضف نقاطا زمنية إضافية حسب الحاجة ، لتوسيع نطاق التسجيل بحيث يمكن تقييم تأثير الاضطراب الجيني.

1. في أيام التسجيل (اليوم 3 و 5 و 7 و 9 من مرحلة البلوغ) ، انظر إلى الصفائح التي يبلغ طولها 6 سم والتي تحتوي على 50 وسجل عدد المشلولة. قم بإزالة المشلولة من اللوحة. إذا زحفت من اللوحة أو ماتت ، فيجب فرض رقابة عليها. سجل الحدث بحيث يمكن حسابه في التحليل.
   ملاحظه: يعتبر مشلولا عندما لا تلاحظ أي حركة بعد تعريضه لمحفزات لمس خفيفة أو لطيفة. يستخدم نشاط ضخ البلعوم لتحديد ما إذا كانت غير المتحركة حية أم ميتة.
2. عند الانتهاء من التجربة ، احسب معدل الشلل لكل حالة. افعل ذلك في كل نقطة زمنية بقسمة جزء المصابة بالشلل على العدد الإجمالي للحيوانات التي لوحظت لتلك الحالة. في حالة ملاحظة لوحات متعددة لكل حالة لكل نقطة زمنية (أي النسخ المتماثل للوحات) ، احسب النسبة بشكل منفصل لكل تكرار.
3. ارسم تطور معدل الشلل في رسم بياني XY (مخطط مبعثر). يمثل X أيام البلوغ ، ويمثل Y معدلات الشلل. تمت مقارنة معدل الشلل لحيوانات unc-54p: :p olyQ:: YFP بحيوانات التحكم (الشكل 1 ج). إجراء التحليل الإحصائي بين المجموعات. بالنسبة للتجارب المتعددة، تعامل مع التجارب بشكل مستقل. استخدم انحدار المخاطر النسبية كوكس واختبار والد. تدعم معظم أدوات تحليل البيانات التي تدعم تحليل البقاء على قيد الحياة أيضا نمذجة كوكس.
   1. تحويل البيانات: يجب أن يحتوي كل شرط على عمودين ، أحدهما للوقت والآخر ل "حدث". في كل نقطة زمنية تمت ملاحظتها ، أضف صفا يحتوي على "0" لكل مشلول و "1" لكل خاضع للرقابة. يجب أن يكون العدد الإجمالي للصفوف مساويا لعدد المبتدئة على اللوحة لهذه الحالة.
   2. قم بإجراء نمذجة Cox Proportional-Hazards ، متبوعا باختبار Wald ، وفقا لتعليمات البرنامج الإحصائي. سيكون النموذج أحادي المتغير مناسبا لتصميمات التجارب النموذجية. لأكثر من شرطين ، إذا كان الاختبار مع جميع الشروط المضمنة يشير إلى نتيجة مهمة (على سبيل المثال ، ص < 0.005) ، يمكن إجراء الاختبارات الزوجية بين الشروط لتحديد زوج (أزواج ) محددة من الشروط.
      ملاحظه: يعتمد نموذج كوكس على افتراض أن شرط (حالات) الاختبار تعدل احتمال وقوع حدث ما بشكل متناسب بمرور الوقت. هذا يعني ، على سبيل المثال ، أن نموذج كوكس لن يكون مناسبا لمقارنة حالة تصاب فيها معظم بالشلل في اليوم الأول بحالة تصاب فيها معظم بالشلل في اليوم التاسع. تتوفر امتدادات نموذج كوكس ، والأساليب الأخرى لمقارنة النسب المشلولة في كل نقطة زمنية ، للحالات التي لا يصمد فيها افتراض المخاطر النسبية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التعبير عن polyQ :: YFP داخل C. ايليجانس العضلة يؤدي إلى تراكم البؤر التدريجي والشلل أثناء الشيخوخة. (أ) C. ايليجانس unc-54p :: Q35 :: YFP التعبير في اليومين 1 و 4 من مرحلة البلوغ (اللوحة العلوية والسفلية ، على التوالي). تشير الأسهم إلى البؤر التمثيلية. (ب) القياس الكمي لبؤر الفلورسنت خلال الأيام الأربعة الأولى من مرحلة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شرائح المجهر الزجاجي VWR هاتف: 160004-422 أزيد الصوديوم ، CAS # 26628-22-8 سيجما ألدريتش S2002 مجهر Zeiss Axio Imager M2m مع برنامج AxioVision v4.8.2.0 زييس Zeiss StemiSV11 M2 Bio مجهر رباعي زييس