مقالة منهجية

مقايسة الحضانة المشتركة للبكتيريا: تقنية قائمة على الفحص المجهري الفلوري لتصور المنافسة البكتيرية غير المحددة على مستوى الخلية المفردة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Smith، S.، et al.، القياس الكمي للمنافسة بين البكتيريا باستخدام التصوير الفلوري أحادي الخلية. J. Vis. إكسب. (2021).

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو طريقة قائمة على الفحص المجهري الفلوري لدراسة المنافسة البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لبنية ووظيفة المجتمعات البكتيرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. Coincubate السلالات البكتيرية

  1. اختر سلالتين بكتيريتين لمقايسات المنافسة البكتيرية أحادية الخلية. هنا ، يتم استخدام سلالتين من V. fischeri: سلالة مستهدفة (ES11424) وسلالة مثبطة (MJ1125) معروفة بقتل السلالة المستهدفة باستخدام نظام إفراز النوع السادس على الكروموسوم الثاني (T6SS2) 1 ، وهي آلية قتل تعتمد على التلامس.
  2. قم بتحويل السلالات باستخدام البلازميدات المستقرة التي تشفر الجينات لبروتينات الفلورسنت المختلفة (على سبيل المثال ، GFP أو RFP) للتمييز بصريا بين أنواع السلالات على المجهر. هنا ، يتم تمييز سلالة المثبط ببلازميد ترميز GFP (pVSV102) ، ويتم تمييز السلالة المستهدفة ببلازميد ترميز dsRed (pVSV208).
  3. ابدأ بثقافات منتصف السجل لكلتا السلالتين ، وقم بقياس وتسجيل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) لجميع العينات.
  4. تطبيع كل عينة إلى OD600 = 1.0 ، وهو ما يتوافق مع حوالي 109 CFU / mL ل V. fischeri ، عن طريق تخفيف الثقافة بوسط LBS.
  5. امزج السلالتين المتنافسيتين معا بنسبة 1: 1 بناء على الحجم عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من كل سلالة طبيعية إلى أنبوب 1.5 مل مسمى. دوامة ثقافة السلالة المختلطة ل 1-2 ثانية < / > ملاحظه: في بعض الحالات ، قد يكون من المناسب خلط الزراعة المشتركة بنسب مختلفة. على سبيل المثال ، عندما تنمو سلالة أسرع بكثير من الأخرى ، قد يكون من الضروري بدء السلالة البطيئة النمو بميزة عددية من أجل مراقبة المنافسة. قد يكون التحسين مطلوبا أيضا إذا كان OD600 لا يتوافق مع CFU / mL مماثل لكلا السلالتين.
  6. كرر الخطوة 1.5 لكل تكرار بيولوجي وعلاج. في المثال الموضح هنا ، سينتج عن ذلك ما مجموعه أربعة أنابيب مختلطة السلالة: مكرران بيولوجيان مع سلالة مثبطة من النوع البري ممزوجة بالسلالة المستهدفة وتكراران بيولوجيان مع السلالة الطافرة لنظام الإفراز من النوع السادس الممزوجة بالسلالة المستهدفة.
  7. للتأكد من أن الخلايا المتنافسة كثيفة بما فيه الكفاية للقتل المعتمد على التلامس في الحضانة المعدنية على وسادة أجار ، قم بتركيز كل مزرعة مختلطة 3 أضعاف عن طريق الطرد المركزي للثقافة المختلطة في أنبوب طرد مركزي قياسي سعة 1.5 مل لمدة دقيقة واحدة عند 21،130 × جم ، والتخلص من المادة الطافية ، وإعادة تعليق كل حبيبات في وسط 20 ميكرولتر رطل. كرر لكل عينة.
    ملاحظه: بعض الخلايا البكتيرية حساسة للتلف الناجم عن الطرد المركزي عند RCF العالي. في مثل هذه الحالات ، يمكن الطرد المركزي للثقافة المختلطة لمدة 3 دقائق عند 4600 × جم. بالإضافة إلى ذلك ، عند تحديد المنافسة المعتمدة على الاتصال ، من المهم ضمان كثافة خلية كافية على الشريحة لمراقبة القتل. في هذه المقالة ، كانت العلاجات "المزدحمة" ، حيث لوحظ القتل ، تحتوي على ما يقرب من 10 خلايا / 20 ميكرومترمربع.

2. إعداد الشرائح

  1. عند استخدام مجهر عمودي ، ضع وسادة من الاغاروز ~ 5 مم2 على شريحة زجاجية قياسية مقاس 1 مم. ضع 2 ميكرولتر من الثقافة المختلطة على وسادة الاغاروز وضع غطاء # 1.5 (25 مم2) فوق البقعة. انظر الشكل 1 ب.
  2. عند استخدام مجهر مقلوب ، ضع 2 ميكرولتر من ثقافة مختلطة على قاع الغطاء # 1.5 لطبق بتري مقاس 35 مم وضع وسادة أغروز ~ 5 مم2 فوق بقعة الحضانة المعدنية. ضع غطاء زجاجي دائري مقاس 12 مم فوق وسادة الاغاروز. انظر الشكل 1 ج للحصول على مثال.
  3. كرر الخطوتين 2.1 أو 2.2 ، اعتمادا على إعداد المجهر المستخدم ، للثقافات المختلطة الثلاث المتبقية ، مما ينتج عنه أربع شرائح أو أطباق ليتم تصويرها.
  4. اسمح للشرائح بالجلوس على سطح الطاولة لمدة 5 دقائق تقريبا قبل المتابعة. هذا يسمح للخلايا بالاستقرار على وسادة أجار والقضاء على الحركة أثناء عملية التصوير.
< p class = "jove_title" >3. الفحص المجهري الفلوري

  1. ابدأ بالتركيز على الخلايا التي تستخدم الضوء الأبيض (تباين الطور أو DIC) لتقليل تأثيرات التبييض الضوئي. بناء على متوسط حجم خلية بكتيرية واحدة ، استخدم هدفا للزيت 60x أو 100x.
  2. اضبط وقت التعرض وإعدادات الاستحواذ لكل قناة بحيث تكون الخلايا مرئية في القناة المناسبة مع الحد الأدنى من اكتشاف الخلفية.
    ملاحظه: من المناسب استخدام أوقات تعرض مختلفة لقنوات مختلفة ، ولكن يجب استخدام نفس وقت التعرض عبر جميع التكرارات البيولوجية والمعالجات لقناة معينة.
  3. لكل عينة ، حدد خمسة حقول رؤية على الأقل (FOV) واحصل على صور في كل قناة مناسبة باستخدام إعدادات الاكتساب (انظر الأمثلة في الشكل 2). احفظ نقاط XY من كل مجال رؤية بحيث يمكن تصوير نفس مجال الرؤية خلال النقطة الزمنية النهائية. يعد تصوير نفس مجال الرؤية في كل نقطة زمنية ضروريا لتحديد نسبة المساحة التي تشغلها الخلايا المستهدفة أو المثبطة أثناء خطوات التحليل.
    ملاحظه: في هذا المثال ، يتم الكشف عن تألق GFP باستخدام مرشح بطول موجة إثارة يتراوح 467 - 498 نانومتر ومرشح انبعاث من 513 - 556 نانومتر ويكون أخضر زائف اللون. تم الكشف عن تألق dsRed باستخدام مرشح بطول موجة إثارة يتراوح 542-582 نانومتر ومرشح انبعاث من 603 - 678 نانومتر وهو أرجواني زائف اللون.
  4. بعد ساعتين ، كرر الخطوة أعلاه لكل عينة باستخدام نقاط XY المحفوظة مسبقا (الشكل 2).
    ملاحظه: قد يلزم تحسين توقيت الصور اللاحقة للكائنات الحية ذات معدلات النمو المختلفة أو الآليات التنافسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: إعداد وسادة الاغاروز وإعداد الشريحة لمقايسات العملة المعدنية. (أ) الإعداد لصنع وسادات الاغاروز بنسبة 2٪. خمس طبقات من شريط المختبر (الأخضر) ملفوفة حول زلة غطاء عند نقطتين تفصل بينهما حوالي 20 مم. بعد ذلك ، يتم سحب اللاغاروسي الدافئ بنسبة 2٪ في محلول ملحي بحري مخزن بالفوسفات (الأصفر) بين قطع الشريط وتغطيته على الفور بزلة غطاء 25 مم2 ويسمح له بالتصلب لمدة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق صياد 05-408-129 10 ميكرولتر ماصة أحادية القناة 1000 ميكرولتر ماصة أحادية القناة 20 ميكرولتر ماصة أحادية القناة 200 ميكرولتر ماصة أحادية القناة أغاروز صياد بي ت 165-25 الاغاروز منخفض الذوبان صحن سيلفيس 35 مم صياد NC0409658 # 1.5 غطاء قاع زجاجي كلورامفينيكول سيغما ج0378 مخزون (20 مجم / مل في الإيثانول) ؛ التركيز النهائي في الوسائط (2 ميكروغرام / مل رطل) برامج تحليل صور فيجي إيمج جيه https://imagej.net/Fiji/Downloads برنامج مفتوح المصدر نظارات غطاء فيشربراند: دوائر صياد 12-545-81 ف # 1.5 غطاء زجاجي ؛ قطر 12 مم كبريتات كاناميسين صياد بي ت 906-5 مخزون (100 مجم / مل في الماء ، تعقيم بفلتر) ؛ التركيز النهائي في الوسائط (1 ميكروغرام / مل رطل) تنظيف المناديل الورقية للعدسة صياد S24530 لوحات بتري صياد FB0875713 معقم مع غطاء شفرات الحلاقه صياد الطراز S65921 كوفيت شبه مايكرو VWR 97000-586 مقياس الطيف الضوئي الشرائح المجهرية العادية الختم الذهبي الحراري العلمي صياد 12-518-100 ب زجاج الغطاء العلمي الحراري العلمي ريتشارد آلان صياد 22-050-235 # 1.5 غطاء زجاجي ، 25 مم 2 زيت الغمر من النوع F صياد NC0297589 مجهر مضان عمودي أو مقلوب مع الكاميرا وبرنامج التصوير تم الحصول على الصور الواردة في هذه المقالة على مجهر الفلورسنت المقلوب من نيكون TI-2 المزود بكاميرا ORCA-Fusion Digital CMOS باستخدام برنامج NIS-Elements. دوار حمام مائي يستخدم للحفاظ على دفء الاغاروز قبل سحب العينة وسائط LBS 1M Tris Buffer (درجة الحموضة ~ 7.5) 50 مل 1 متر مخزن مؤقت (62 مل حمض الهيدروكلوريك ، 938 مل ماء DI ، 121 جم قاعدة Trizma) أجار التقنية صياد DF0812-17-9 15 جم (أضف فقط للأطباق) ماء DI 950 مل كلوريد الصوديوم صياد S640-3 20 جرام التربتون صياد BP97265 10 جرام مستخلص الخميرة صياد ص9727-2 5 جرام mPBS (PBS البحري) محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع إضافة أملاح بحرية ؛ يستخدم لصنع وسادة الاغاروز 10X PBS صياد ICN1960454 ملح البحر الفوري للمحيط المحيط الفوري SS1-160P اضبط التركيز على الملوحة المناسبة ؛ 20 وحدة مئوية تستخدم هنا وحدات تصفية فراغ معقمة صياد SCGVU01RE تستخدم لتعقيم mPBS مضخة فراغ تستخدم لتعقيم mPBS

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DIC

مقالات ذات صلة