مقايسة متجانسة للقرب المضيء المضخم: اختبار القرب القائم على الخرزة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع تفاعلات البروتين والبروتين

الملخص

المصدر: Wang، L. et al. ، دراسات تفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام الفحص المتجانس القائم على الخرز. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح الاختبار المتجانس المتجانس للقرب المضيء المضخم - مقايسة القرب القائم على الخرز. إنه يستخدم حبات متقبل ومتبرع متجانسة الحجم ، مثبتة ببروتينين يميلان إلى التفاعل لفحص الجزيئات الصغيرة المحتملة التي تمنع تفاعلات البروتين.

البروتوكول

ملاحظة: تظهر نظرة عامة على هذا البروتوكول في الشكل 1.

< p class = "jove_title" >1. التعبير عن GST-FKBP51 و GST-FKBP52 وتنقيتها (الشكل 1 أ)

1. البلازميدات
   ملاحظة: احصل على استنساخ (كدنا) ل FKBP51 البشري (معرف الاستنساخ: 5723416) ول FKBP52 البشري (معرف الاستنساخ: 7474554) من اتحاد IMAGE.
   1. تضخيم الحمض النووي البشري FKBP51 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات (إلى الأمام ؛ 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3 '، للخلف ؛ 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على BamHI و XhoI المتدلية واستنساخها في ناقل pGEX6-1 في مواقع تقييد BamHI / XhoI.
   2. تضخيم الحمض النووي البشري FKBP52 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات (إلى الأمام ؛ 5'-GAATTCATGACAGCCGGAGGAGATG-3 '، للخلف ؛ 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على EcoRI و XhoI المتدلية واستنساخها في ناقل pGEX6-2 في مواقع تقييد EcoRI / XhoI.
      ملاحظه: يتم عرض إعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وشروطه في الجدول 1 والجدول 2.
   3. تحقق من التسلسل المدرج وقم بتحويل البلازميدات إلى بكتريا قولونية مختصة كيميائيا وفقا لبروتوكول التصنيع.
2. التعبير عن البروتين وتنقيته
   1. أضف 25 جم من قاعدة مرق لوريا (LB) في 1 لتر من الماء المقطر لعمل محلول LB. قم بالتعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد ، أضف 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
   2. خذ مستعمرة من البكتيريا التي تعبر عن GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 واخلطها مع 500 ميكرولتر من محلول LB في أنبوب سعة 1.5 مل. دوار.
   3. أضف خليط "1.2.2" إلى 1 لتر من محلول LB في قارورة Erlenmeyer المغطاة بورق الألمنيوم. احتضن قارورة Erlenmeyer في شاكر طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   4. تحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوسيد (IPTG) إلى قارورة إرلينماير واستمر في الحضانة لمدة ساعتين أخرى.
   5. للحصول على كريات الخلية ، جهاز طرد مركزي عند 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة><. ملاحظه: يمكن تخزين كريات الخلية عند -20 درجة مئوية.
   6. أعد تعليق كريات الخلية في 40 مل من PBS وصوتنة 3 × 20 ثانية على الجليد. أضف 1 ملي مولار من PMSF و 1 ملي EDTA وكوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني (1 قرص) لمنع تحلل البروتينات.
   قم
   7. بالطرد المركزي للتعليق لمدة 30 دقيقة 50,000 × جم لإزالة حطام الخلية وتطبيق المادة الطافية على عمود مصيدة ضريبة السلع والخدمات سعة 5 مل.
   8. بعد غسل العمود ب 30 مل من PBS ، قم بإزالة GST-FKBP51 و GST-FKBP52 مع 5 مل من 10 ملي مولار من الجلوتاثيون في PBS.
   9. تركيز البروتينات على وحدة الطرد المركزي 15 مل 10.000 MWCO. لإزالة الجلوتاثيون الحر ، قم بتمرير المركزات عبر عمود PD-10 المتوازن مع 0.5x PBS وركز مرة أخرى على جهاز الطرد المركزي للمرشح.
   10. اجمع الكسور المحتوية على البروتين. تحقق من البروتينات في SDS-PAGE واضبط تركيزات البروتين على 1 مجم / مل
       ملاحظه: إنتاجية البروتين النموذجية هي 2-5 مجم / لتر مزرعة. يمكن تخزين البروتين عند -20 درجة مئوية.

فئة

2. اقتران الببتيد الطرفي Hsp90 C بخرز المستقبل (الشكل 1 ب)

1. تحضير الببتيد Hsp90
   1. قم بتصنيع عشرة ببتيد من الأحماض الأمينية NH 2-EDASRMEEVD-COOH المقابلة للأحماض الأمينية 714-724 من الشكل الإسوي بيتا Hsp90 البشري (UniProt ID: P08238) بواسطة خدمة تخليق الببتيد.
   2. خفف الببتيد Hsp90 في PBS بتركيز 1 مجم / مل.
2. تحضير حبات المتقبل
   1. قم بتخفيف حبات المستقبل غير المترافقة في PBS بتركيز 1 مجم / مل ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
   2. قم بإجراء الغسيل بالطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
3. الاقتران
   1. اضبط النسبة بين الخرز والببتيد على أنها 10: 1. في الأنبوب سعة 1.5 مل الذي يحتوي على 1 مجم من حبيبات حبة المستقبل (المحضرة كما هو موضح أعلاه) ، أضف 1 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) ، 0.1 مجم من الببتيد المخفف ، 1.25 ميكرولتر من Tween-20 ، 10 ميكرولتر من محلول 400 ملي مولار من سيانوبوروهيدريد الصوديوم (NaBH₃CN) في الماء.
      أنذر: NaBH₃CN سام. استخدم غطاء الدخان والقفازات. يجب تحضير محلول NaBH₃CN حديثا.
   2. احتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع تحريك طرف إلى طرف (10-20 دورة في الدقيقة) على شاكر دوار.
4. تبريد رد الفعل وغسل الخرز
   1. أضف 20 ميكرولتر من محلول 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) إلى التفاعل لمنع المواقع غير المتفاعلة. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
   2. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم (أو السرعة القصوى) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخرزة في 1 مل من محلول Tris-HCl (100 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.0).
   3. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
   4. بعد الطرد المركزي الأخير ، قم بتعليق الخرزات عند 1 مجم / مل في مخزن التخزين المؤقت (1 مل من 0.5 × PBS مع 0.01٪ أزيد الصوديوم كمادة حافظة). قم بتخزين محلول حبة المستقبل المترافق عند 4 درجات مئوية محمي من الضوء.
      أنذر: أزيد الصوديوم سام. استخدم غطاء الدخان والقفازات.

< p class = "jove_title" >3. الفحص الذي يفحص التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 و Hsp90 C-terminal الببتيد ، والتثبيط مع مركبات الكتلة الجزيئية الصغيرة (الشكل 1 ج)

1. البروتينات الموسومة بضريبة السلع والخدمات التي تتفاعل مع حبات مانحة للجلوتاثيون
   1. قم بإعداد التفاعلات في 384 بئر من الأطباق.
   2. تحضير المحلول الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من حبات المتبرع بالجلوتاثيون في 0.5x PBS ، درجة الحموضة 7.4.
      ملاحظه: بعد التخزين المطول ، تستقر الخرزات وتحتاج إلى دوامة.
   3. أضف GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام/مل.
   4. احتضن في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
      ملاحظه: في هذه الخطوة ، ستتفاعل البروتينات الموسومة بضريبة السلع والخدمات مع الجلوتاثيون المرتبط بالخرز. لكل بئر ، سيتم استخدام 22.5 ميكرولتر من هذا الخليط. ويجب تحديد تركيز الشركاء الملزمين تجريبيا. قم بالمعايرة GST-FKBP51 و GST-FKBP52 واختر التركيز الذي يعطي أفضل إشارة.
2. إضافة الكمبوند
   1. قم بعمل تخفيفات تسلسلية لمركبات الاختبار في DMSO.
      ملاحظه: التركيزات المستخدمة عادة ما تكون 10 و 30 و 100 و 300 و 1,000 و 3,000 ميكرومتر.
   2. أضف 0.25 ميكرولتر من DMSO (التحكم السلبي) أو الببتيد الطرفي Hsp90 C (التحكم الإيجابي ، 30 ميكرومتر) أو المركبات في DMSO إلى زاوية كل بئر من اللوحة. استخدم ثلاث نسخ لكل تركيز مركب.
   3. أضف 22.5 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على حبات مانحة للجلوتاثيون مع بروتينات تحمل علامة ضريبة السلع والخدمات إلى كل بئر.
   4. رج الطبق برفق باليد ولكن جيدا. احتضن في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة
      ملاحظه: خلال هذا الوقت ، ستتفاعل المركبات مع مجال TPR في موقع ربط الببتيد الطرفي Hsp90 C.
3. إضافة حبات المتقبل
   1. قم بتخفيف حبات المستقبل باستخدام الببتيد الطرفي Hsp90 C المرفق إلى 100 ميكروغرام / مل في 0.5x PBS.
   2. أضف 2.25 ميكرولتر من حبات المستقبل المخففة إلى كل بئر.
   3. تخلط بلطف ولكن جيدا. احتضن في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة
      ملاحظه: في هذه الخطوة ، يتم الاقتراب من الخرز المتبرع والمتقبل من خلال تفاعلات البروتين والببتيد. الحجم النهائي لخليط التفاعل هو 25 ميكرولتر. لذلك ، تتراوح التركيزات النهائية للمركبات من 0.1 إلى 30 ميكرومتر.
4. قراءة اللوحة
   ملاحظه: اقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة تم ضبطه في الوضع ذي الصلة.
   1. قم بتشغيل الجهاز وافتح البرنامج
   2. اختر البروتوكول ذي الصلة.
   3. انقر فوق تحرير خريطة اللوحة وحدد البئر المستخدم في اللوحة للقياس.
   4. انقر فوق التالي لمتابعة وتشغيل البروتوكول المحدد.
   5. بعد القياس، انقر فوق إظهار النتائج لعرض النتائج.
   6. تصدير البيانات.

الجدول 1: تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم إعداده لتضخيم الحمض النووي البشري FKBP51 و FKBP52.

مكون رد الفعل الحجم (ميكرولتر) عازلة PCR (5 × مركز) 4 التمهيدي الأمامي 1 التمهيدي العكسي 1 البلازميد 0.5 مزيج dNTP (10 ملي مولار لكل منهما) 0.5 بوليميراز الحمض النووي فوسيون 0.5 الماء (درجة الحمض النووي) 12.5 مجموع 20

الجدول 2: ظروف الحرارة لتضخيم الحمض النووي البشري FKBP51 و FKBP52.

مرحلة درجة الحرارة (درجة مئوية) الوقت دورات التمسخ الأولي 94 3 دقائق 1 التمسخ 94 30 ثانية 35 الصلب 56 30 ثانية امتداد 72 1 دقيقة التمديد النهائي 72 5 دقائق 1 ملاحظة: درجة حرارة الغطاء 105 درجة مئوية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي لهذا البروتوكول. (أ) التعبير عن GST-FKBP51 و GST-FKBP52 وتنقيتهما. (ب) اقتران الببتيد الطرفي Hsp90 C بخرز المستقبل. (ج) الفحص الذي يفحص التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 و Hsp90 C-terminal الببتيد. تثبيط مركبات الكتلة الجزيئية الصغيرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 384 بئر بيركين إلمر 6008350 حجم الفحص 25 مل وحدة الطرد المركزي Amicon 10.000 MWCO ميليبور UFC901008 بروتين مركز أمبيسلين سيغما أ 0166 المضادات الحيويه شاكر البكتيريا Unimax 1010 هايدولف بكتيريا الثقافة استنساخ (كدنا) للإنسان FKBP51 المصدر: العلوم البيولوجية معرف الاستنساخ: 5723416 متجه pCMV-SPORT6 استنساخ (كدنا) للإنسان FKBP52 المصدر: العلوم البيولوجية معرف الاستنساخ: 7474554 متجه pCMV-SPORT6 الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا إنفيتروجين C602003 طلقة واحدة BL21 ستار (DE3) DMSO سوبيلكو 1.02952.1000 المركبات المخففة DPBS جيبكو 14190-144 تحضير الحل EDTA كالبيوكيم 344504 منع الانحلال البروتيني أثناء الصوتنة الجلوتاثيون سيغما جي 4251 البروتينات الموسومة بضريبة السلع والخدمات حبات المتبرع بالجلوتاثيون بيركين إلمر 6765300 حبة المتبرع عمود تراكب ضريبة السلع والخدمات سيتيفا (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) 17528201 تنقية البروتينات الموسومة بضريبة السلع والخدمات الأيزوبروبيل β د ثيوغالاكتوسيد ثيرمو فيشر العلمي R0392 تحفيز التعبير عن البروتين مرق LB (ميلر) سيغما L3522 وسط النمو الميكروبي أداة PCR بيو راد S1000 التدوير الحراري التضخيم / تفاعل البوليميراز المتسلسل عمود PD-10 سيتيفا (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) 17085101 تبادل الحلول متجه pGEX-6P-1 سيتيفا (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) 28954648 البلازميد متجه pGEX-6P-2 سيتيفا (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) 28954650 البلازميد قارئ اللوحة بيركين إلمر قارئ EnSpire 2300 متعدد التسميات قراءة لوحة ألفا برنامج قارئ اللوحة بيركين إلمر مدير EnSpire برنامج قارئ اللوحة بروتوكول برنامج قارئ اللوحة بيركين إلمر ألفا 384 بئر منخفض الحجم استخدم هذا البروتوكول لقراءة اللوحة PMSF سيغما ص 7626 منع الانحلال البروتيني أثناء الصوتنة كوكتيل مثبط البروتياز سيغما S8830 منع الانحلال البروتيني أثناء الصوتنة أزيد الصوديوم سيغما S2002 كمادة حافظة سيانوبوروهيدريد الصوديوم (NaBH3CN) سيغما 156159 ينشط مصفوفة للاقتران عشرة ببتيد من الأحماض الأمينية NH2-EDASRMEEVD-COOH المقابلة للأحماض الأمينية 714-724 من الشكل الإسوي Hsp90 beta البشري الببتيد 2.0 inc توليف الببتيد الطرفي Hsp90 C أنبوب الاختبار الدوار لابينكو قم بإجراء تحريض من طرف إلى طرف تريس حمض الهيدروكلوريك سيغما 10708976001 حظر المواقع غير المتفاعلة لخرزات المستقبل توين 20 سيغما ص 1379 منع تجميع الخرز جهاز طرد مركزي فائق Avanti J-20 XP بيكمان كولتر جهاز طرد مركزي للحصول على كريات الخلايا البكتيرية تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية ميكروسون خلايا صوتية لإطلاق البروتين حبات المستقبل غير المقترنة بيركين إلمر 6762003 حبات المتقبل XCell SureLock Mini-Cell وXCell II Blot Module إنفيتروجين EI0002 صفحة SDS