فحص لويحات الفيروس: تقنية لقياس فيروس الهربس البسيط المعدي عن طريق القياس الكمي للويحات المتكونة في طبقة أحادية من الخلايا المصابة بالفيروس

الملخص

المصدر: Sadowski ، L. A. et al. لواء فيروسات الهربس البسيط. J. Vis. Exp. (2021)

يصف هذا الفيديو مقايسة البلاك الفيروسي لفيروس الهربس البسيط المعدي أو فيروس الهربس البسيط المعدي. يتم تلقيح الجسيمات الفيروسية المخففة في الطبقة الأحادية للخلايا الظهارية. عند الحضانة ، يشكل الفيروس لويحات ويتم عدها بصريا لتحديد عيار الفيروس المعدي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بذر خلايا Vero

1. في اليوم السابق لبدء فحص البلاك ، قم بتربسين خلايا Vero وإعادة تعليقها في Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) العادي والمكملات وفقا لمنهجية زراعة الخلايا القياسية. أعد تعليق الخلايا المصابة بالتربسين في 10 مل من DMEM لكل قارورة T-75 لخلايا Vero المتقاربة (~ 10⁷ خلايا).
   ملاحظة: يستخدم DMEM لمقايسات البلاك بدلا من alpha-MEM لأنه يبطئ قليلا معدل نمو الخلايا ويفضل نتائج فحص البلاك بشكل أفضل.
2. عد الخلايا بالطريقة المفضلة لدى المرء (على سبيل المثال ، مقياس كثافة الدم القياسي مع استبعاد Trypan Blue).
3. زرع الخلايا في 4 × 10⁶ خلايا / صفيحة ؛ بالنسبة ل HSV-2 ، استخدم ألواح 6 آبار مع 2.5 مل من DMEM (مع المكملات الغذائية) لكل بئر ؛ وبالنسبة ل HSV-1 ، استخدم ألواح 12 بئرا مع 1.25 مل من DMEM (مع المكملات الغذائية) لكل ب><ئر. ملاحظة: يجب أن يكون عدد الخلايا ثابتا بغض النظر عن اللوحة المستخدمة ، على الرغم من أن حجم الآبار مهم فيما يتعلق بالدقة في فحص البلاك. من الضروري توزيع الخلايا بالتساوي ، والتي يمكن تحقيقها بشكل أكثر فاعلية عن طريق تحريك اللوحة ذهابا وإيابا ، وليس بطريقة دائرية.
4. اسمح للخلايا بالنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة مرطوبة.
   ملاحظة: يتم الحفاظ على الرطوبة باستخدام وعاء من الماء المقطر يحتوي على مبيد للطحالب في قاع الحاضنة.

< p class = "jove_title" >2. تخفيف العينة

1. أكمل تخفيف العينة وإضافة الفيروس إلى الخلايا في جلسة معملية واحدة.
   تحذير: فيروس الهربس البسيط -1 و -2 معدان للإنسان ويجب التعامل معهما في ظل احتواء السلامة البيولوجية المناسب (BSL-2). احتفظ بجميع المواد التي تتلامس مع الفيروس منفصلة وقم بتطهيرها بعامل رباعي عند تخفيف 1/256 (انظر جدول المواد) أو اليودوفور أو المبيض أو المنظفات الأيونية القوية (على سبيل المثال ، SDS) قبل إزالتها من خزانة السلامة الحيوية.
2. في اليوم التالي لبذر خلايا Vero ، قم بتخفيف كل عينة من الفيروسات بشكل متسلسل ليتم تخفيفها في 1x PBS ؛ عادة ما تستخدم تخفيفات 10 أضعاف للتتبع الأكثر دقة.
3. قم بإجراء هذه التخفيفات من خلال ^10-4 (للتركيزات المنخفضة من الفيروسات) أو من خلال ^10-9 (لتوقعات عينات العيار الأعلى) مع بقاء 1 مل على الأقل من كل عينة لمقايسة البلاك نفسها.
4. احتفظ بجميع التخفيفات الفيروسية على الجليد (لا تزيد عن 1 ساعة) حتى تصبح جاهزة لإضافة عينات الفيروس المخففة هذه إلى الخلايا.

< p class = "jove_title" >3. إضافة الفيروس إلى الخلايا

1. قم بإزالة وسط زراعة الخلية من بئر أو بئرين بواسطة ماصة.
   ملاحظة: لا تستخدم الشفاط لأنه يزيل الكثير من السوائل من الطبقة الأحادية للخلية ويجفف الخلايا. أحد الاعتبارات الحاسمة هو التأكد من أن الخلية أحادية الطبقة تظل رطبة طوال فترة التجربة بأكملها. إذا جفت الخلايا ، فسوف تغسل اللوحة في الخطوة الأخيرة وتولد بيانات غير قابلة للاستخدام. لذلك ، قم بمعالجة بئر واحد أو اثنين فقط في كل مرة لتقليل هذا الاحتمال.
2. أضف عينة الفيروس المخففة بعناية (يتم استخدام 100-400 ميكرولتر و 50-200 ميكرولتر من عينة الفيروس لألواح 6 بئر و 12 بئرا ، على التوالي) بالتنقيط إلى كل طبقة أحادية ، مع إضافة القطرات أسفل جانب كل بئر. كرر العملية لكل بئر أو بئرين حتى تمتلئ اللوحة بأكملها بعينات الفيروس التي يتم تغطيتها باللويحات.
   ملاحظة: قد تؤدي إضافة القطرات إلى وسط البئر إلى إزالة الخلايا عن غير قصد من الركيزة.
3. قم بهز اللوحة بأكملها يدويا برفق للتأكد من أن PBS الذي يحتوي على الفيروس يغطي الطبقة الأحادية الكاملة من الخلايا في كل بئر ، ثم ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية للسماح للفيروس بالامتصاص.
4. كل 10 دقائق في غضون ساعة واحدة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وهزها برفق مرة أخرى لنشر الفيروس بشكل متساو عبر كل بئر ، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة.
   ملاحظة: ستحدد كل تجربة عدد التكرارات والتخفيفات المستخدمة. تفضيل القارئ يملي هذا القرار.
5. لتقليل إمكانية عد اللقاح غير الممتص عن غير قصد ، قم بإزالة عينة الفيروس من الآبار بأطراف ماصة 1000 ميكرولتر وضعها في دورق نفايات.
   ملاحظة: مرة أخرى ، يتم إجراء هذا الإجراء باستخدام بئر واحد أو بئرين فقط في كل مرة للحفاظ على ترطيب طبقة الخلية الأحادية.
6. ضع 2.5 مل من تراكب ميثيل السليلوز (قم بإذابة 5٪ ميثيل السليلوز وزن / وزن في 100 مل من PBS ، والأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة في دورة سائلة ، ثم أضف 375 مل من DMEM بالإضافة إلى 25 مل من FBS).
7. بمجرد أن تحتوي اللوحة بأكملها على تراكب ، ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة للسماح بالنمو لمدة يومين.
   ملاحظة: إذا سمح للفيروس والخلايا بالنمو لمدة ثلاثة أيام ، حتى في مكملات DMEM plus ، فقد ينتج عن ذلك فقدان كبير للخلايا في الطبقة الأحادية ، مما يعرض البيانات النهائية للخطر.
8. قم بتطهير دورق النفايات ، عادة بإضافة المبيض أو اليودوفور أو مبيد فيروسات مماثل ، قبل إزالته من خزانة السلامة الحيوية.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تلطيخ اللويحات

1. بعد الحضانة لمدة يومين ، قم بإزالة تراكب ميثيل السليلوز بواسطة ماصة ، مرة أخرى بئر واحد أو بئرين في كل مرة ، وضعه في دورق نفايات.
2. أضف ~ 2 مل من البنفسج البلوري 1٪ (انظر جدول المواد) في 50٪ من الإيثانول إلى كل بئر لتلطيخ اللويحات.
   ملاحظة: ليس من الضروري إزالة كل قطرة أخيرة من التراكب.
3. احتضان اللوحة بجميع الآبار المملوءة بالبقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، قم بتطهير دورق النفايات على النحو الوارد أعلاه في الخطوة 3.8.
4. اغسل الأطباق بقوة بماء الصنبور حتى يصبح الجريان السطحي صافيا.
   ملاحظة: تيار لطيف من الماء ليس قويا بما فيه الكفاية. مطلوب ضغط كامل من تركيبات حوض المختبر.
5. في هذه المرحلة ، تأكد من وجود اختلافات بمقدار 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات عبر كل سلسلة تخفيف.
6. اترك الألواح تجف طوال الليل رأسا على عقب ، وبعد ذلك يمكن حساب اللويحات الفردية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 بئر لوحات كورنينج 3512 ريال 6 أطباق جيدة كورنينج 3516 ألفا ميم لونزا 12169 فهرنهايت مضاد حيوي / مضاد للفطريات جيبكو 15240096 كريستال بنفسجي ألفا إيسار B2193214 DMEM جيبكو 11965092 PBS من Dulbecco (بدون Mg ++ أو Ca ++) جيبكو 14190144 مصل ربلة الساق الجنينية ميليبور سيجما TMS-013-ب L-alanyl-L-جلوتامين (Glutamax) جيبكو GS07F161BA مقياس الدم ثيرمو فيشر 02-671-54 ميثيل السليلوز ميليبور سيجما 27-441-0 العامل الرباعي (Lysol I.C.) ثيرمو فيشر NC9645698 تريبان بلو كورنينج 25900CI التربسين سيتيفا SH30042.01 خلايا فيرو ATCC CCL-81