وضع العلامات الطرفية dUTP Nick بوساطة النقل الطرفي - اختبار TUNEL: طريقة في الموقع للكشف عن تجزئة الحمض النووي في الخلايا المبرمج

الملخص

المصدر: Brannelly، L. A.، et al. باستخدام وضع العلامات الطرفية dUTP Nick End-Labeling بوساطة النقل الطرفي (TUNEL) وفحوصات Caspase 3/7 لقياس موت خلايا البشرة في الضفادع المصابة بالفطريات الفطرية. J. Vis. إكسب. (2018).

في هذا الفيديو، يتم إجراء اختبار TUNEL للكشف عن وجود خلايا موت الخلايا المبرمج في العينة. تتضمن الدراسة استخدام بوليميراز الحمض النووي الخاص - ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي - الذي يحفز إضافة dUTPs المسمى إلى الطرف 3 من الحمض النووي المجزأ ، والذي يمكن ملاحظته وتحديده تحت المجهر الفلوري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. اختبار TUNEL

1. القتل الرحيم للحيوانات التي تظهر عليها علامات سريرية لفطار الفطريات وعدد متساو من المكافحة سلبية Bd.
2. قم بتشريح عينات الجلد (الظهرية والبطنية والفخذ) من كل. إصلاح عينات الجلد لمدة 2 ساعة في 4٪ حجم / حجم الفوسفات الفورمالديهايد المخزن مؤقتا. يسمح وقت التثبيت القصير والمتسق بإصلاح الأنسجة بالكامل ، ولكنه يسمح أيضا بتلوين الكيمياء المناعية بشكل فعال ودقيق. ثم انقله إلى 80٪ من الإيثانول حتى يتم تضمينه للتقسيم.
3. قم بتضمين الجلد في شمع البارافين للتحضير النسيجي باتباع الطرق القياسية. باختصار ، البروتوكول على النحو التالي:
   1. تجفيف الأنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول وإزالة الإيثانول بالزيلين. قم بتضمين الأنسجة في شمع البارافين وضع عينات الجلد الثلاث لكل فرد في كتلة بارافين واحدة.
4. قسم الجلد باستخدام ميكروتوم باتباع التحضير النسيجي القياسي. قسم الأنسجة بشكل متسلسل عند 5 ميكرومتر ثم قم بتثبيتها على شرائح زجاجية محبة للماء. ضع أربعة أقسام تسلسلية لكل نوع بشرة لكل شريحة. قم بعمل ثلاث شرائح لكل فرد مع أقسام الجلد التسلسلية ، تذكر أن كل شريحة تحتوي على أربعة أقسام من كل نسيج ملصق.
5. وصمة عار الشرائح بالترتيب التالي:
   1. تلطيخ الشريحة الأولى بالهيماتوكسيلين متبوعا بتلطيخ اليوزين (H & E). هذه الشريحة هي تصور موقع Bd sporangia داخل الجلد.
   2. قم بتلطيخ الشريحة الثانية بعد اختبار TUNEL المتاح تجاريا للتحضير النسيجي واتبع تعليمات الشركة المصنعة الموضحة أدناه.
      1. أولا ، قم بإزالة البارافينات من أقسام الأنسجة في وعاء كوبلين عن طريق غسل الشرائح بثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل غسلة وتبعها بتغييرين بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل غسلة. اتبعه بغسلة واحدة من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 3 دقائق ثم 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق. انتهي بغسل واحد من PBS لمدة 5 دقائق.
      2. عالج الأنسجة مسبقا بإنزيم هضم البروتين المخفف حديثا (بروتيناز K بتركيز 20 ميكروغرام / مل مخفف في PBS) ، وأضفه مباشرة إلى الشريحة. اتركيه للاحتضان لمدة 15 دقيقة. يغسل بتغييرين من PBS في وعاء كوبلين لمدة دقيقتين لكل منهما.
      3. اضغط على السائل الزائد وقم بإخماد بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3.0٪ في PBS في وعاء كوبلين لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. اشطفها مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل غسلة.
      4. اضغط على السائل الزائد ، ثم ضع 75 ميكرولتر / 5 سم² من المخزن المؤقت للتوازن مباشرة على الأنسجة الموجودة على الشريحة. احتضان لمدة 10 ثوان. اضغط على السائل الزائد حول القسم وقم بتطبيق 55 ميكرولتر / 5 سم² من إنزيم ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) الطرفي العام. احتضان في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      5. بعد حضانة TdT ، ضع الشريحة في وعاء كوبلين من المخزن المؤقت لإيقاف / غسيل قوة العمل ، وحركها لمدة 15 ثانية ، واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشريحة بثلاثة تغييرات من PBS لمدة 1 دقيقة لكل غسلة. اضغط على السائل الزائد.
      6. ضع مضاد الديجوكسيجينين المترافق (الرودامين) الذي تم تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة على الأنسجة ، 65 ميكرولتر / 5 سم². احتضن في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجنب التعرض للضوء. يغسل بأربعة تغييرات من PBS لمدة 2 دقيقة لكل غسلة. اضغط على السائل الزائد.
      7. قم بإنهاء ذلك بإضافة 15 ميكرولتر من 0.5 - 1 ميكروغرام / مل DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) في وسط تركيب الشريحة إلى الشريحة ، والتي تعمل كوصمة عار مضادة. ثم قم بتغطيتها بزلة غطاء وختمها بطلاء الأظافر أو الأسمنت المطاطي. اترك الشرائح تجف في الظلام لأن الفحص حساس للضوء.
   قم
   3. بتلطيخ الشريحة الثالثة باستخدام مقايسة TUNEL وصبغة DAPI المضادة ولكن استخدمها كعنصر تحكم إيجابي وسلبي لكل عينة.
      ملاحظة: من بين 4 أقسام نسجية على شرائح التحكم ، فإن أول 2 عبارة عن تكرارات تحكم إيجابية وآخر 2 عبارة عن تكرارات تحكم سلبية.
      1. بالنسبة للعناصر الإيجابية ، بدلا من الخطوة 1.5.2.2 ، قم بمعالجة الأنسجة مسبقا باستخدام مخزن DN المؤقت (30 ملي مولار قاعدة trizma ، درجة الحموضة 7.2 ، 4 ملي مولار MgCl₂ ، 0.1 ملي دي.دي.تي) واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم قم بإذابة Dnase I في المخزن المؤقت DN للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.1ug / mL ، وقم بتطبيقه مباشرة على الشريحة. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشريحة ب 5 غسلات من dH₂O لمدة 3 دقائق في كل غسلة. امسح السائل الزائد. ثم يستأنف اختبار TUNEL وفقا للتوجيهات الواردة في القسم 1.5.2.3.
      2. بالنسبة للعناصر الضابطة السلبية ، لا تضيف إنزيم ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي (TdT) إلى تلك العينات (كما هو موضح في القسم 1.5.2.4).

2. راقب شرائح TUNEL فور الانتهاء من الفحص.

1. التقط صورا على فترات عشوائية على طول كل قسم من أقسام الجلد عند 200X باستخدام مجهر فلوري ، باستخدام مرشحات لكل من بقعة الرودامين ، التي تكشف عن الخلايا المبرمجة وتظهر باللون الأحمر ، و DAPI الذي يكشف عن جميع النوى ويظهر باللون الأزرق ، بحيث يمكن إنشاء تراكب من الخلايا. تأكد من تصوير ما لا يقل عن 100 خلية لكل قسم من الجلد لكل عينة. قم بتخزين الشرائح في صندوق مجهر مظلم عند -20 درجة مئوية.
2. عد الخلايا (ملطخة باللون الأزرق DAPI) لكل صورة. تأكد من حساب ما لا يقل عن 100 خلية لكل قسم من أقسام الجلد. للوصول إلى 100 خلية، احسب جميع الخلايا داخل الصورة. إذا كان هناك أقل من 100 خلية في صورة واحدة ، فقم بحساب صورة أخرى حتى يتم الوصول إلى 100 خلية على الأقل لكل قسم من الجلد لكل.
3. بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا الإيجابية ل TUNEL في نفس الصور (ملطخة بالرودامين الأحمر). الخلايا الإيجابية ل TUNEL ، والتي تشير إلى موت الخلايا المبرمج وليس النخر أو الخلفية ، هي خلايا مفردة ذات حواف خلوية واضحة (الأغشية سليمة بدون تحلل). في بعض الأحيان تتقلص الخلايا لتشكيل أجسام موت الخلايا المبرمج.
4. حدد المناطق التي تم حسابها في مقايسة TUNEL وحلل المناطق المقابلة على الأقسام النسيجية الملطخة ب H & E. تأكد من أن الأقسام الملطخة ب H & E تتوافق مع مواقع عدوى Bd ، مما يضمن استخدام المواقع المصابة بمرض المسال عند حساب الخلايا المبرمج في مقايسة TUNEL.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بولارستار أوميغا بي إم جي لابتك قارئ لوحة مضيئة 384 بئر مسطحة صفيحة سفلية واضحة كورنينج 3707 384 بئر شفة منخفضة بيضاء مسطحة صفيحة كورنينج 3570 Formal-Fixx 10٪ فورمالين محايد مخزن مؤقت صياد 6764254 مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج في الموقع ApopTag Red ميرك ميليبور S7165 PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.2 (1X) حراري / حياة 20-012-043 بارافيلم بيميس PM996 الإيثانول ، 200 دليل ، درجة جزيئية صياد BP2818500 ZEISS Axio مسح الفلورسنت كارل زايس مجهر فلورسنت صفائح بتري لزراعة الخلايا نونك 263991