فحص Caspase-3/7: فحص قائم على اللمعان لتحديد موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس أنشطة Caspase-3/7 في استخلاصات جلد الضفادع

الملخص

المصدر: Brannelly، L. A. et al.، باستخدام وضع العلامات الطرفية dUTP Nick End-Labeling بوساطة النقل الطرفي (TUNEL) وفحوصات Caspase 3/7 لقياس موت خلايا البشرة في الضفادع المصابة بالفطريات الفطرية. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو مقايسة مضيئة Caspase-3/7 في المختبر لتحديد موت الخلايا أو موت الخلايا المبرمج. يقيس الاختبار اللمعان الناتج بعد انقسام caspase-3/7 لركيزة DEVD المؤيدة للإضاءة. يتناسب التلألؤ المتولد مع نشاط caspase-3/7.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تربية والمراقبة

1. المنزلية بشكل فردي ، في بيئة مناسبة للأنواع ، مع جدول مناسب للمياه والتغذية والتنظيف. افحص يوميا.
   1. استخدم الأفراد البالغين من Litoria verreauxii alpina المهددة (لاختبار Caspase 3/7 ، القسم 4) ، المتبرع بها من مرافق التربية الأسيرة. حافظ على عند 15-18 درجة مئوية ، على ركيزة من الطحالب والحصى ، ورشها يوميا بماء التناضح العكسي ، وأطعمها 3 مرات أسبوعيا باستخدام الصراصير المحملة بالقناة الهضمية.
2. جمع البيانات عن كل فرد مرة واحدة أسبوعيا. امسح الأفراد من أجل Bd كما هو موضح في الخطوة 2.1. قم بوزن كل إلى 0.1 جم تقريبا باستخدام ميزان، وقم بقياس طول أنفه للتنفيس (SVL) إلى أقرب 0.01 مم باستخدام ملاقط القرص.
3. بعد التلقيح (كما هو موضح في القسم 3) ، افحص يوميا بحثا عن العلامات السريرية للعدوى (انزلاق الجلد غير المنتظم ، أو عدم الشهية ، أو احمرار الساق ، أو الخمول ، أو تأخر المنعكس التصحيحي) وفقا لإرشادات أخلاقيات. القتل الرحيم للحيوانات في حالة وجود علامات سريرية ومراضة.
   1. القتل الرحيم بجرعة زائدة من ميثان سلفونات التريكيين (MS222) (0.1٪ وزن / حجم MS222 إلى درجة الحموضة 6-7 مع بيكربونات الصوديوم في ماء الصنبور القديم). احتفظ بالحيوانات في MS222 لمدة 10 دقائق بعد توقف كل الحركة ولا تظهر أي استجابة للمنبهات.

< p class = "jove_title" >2. اختبار عدوى BD

1. مسحة لفيتامين ب
   1. امسح كل بمسحة حرير صناعي معقمة جديدة (مسحة واحدة لكل). استخدم طريقة المسح التالية: خمس مرات على فتحة التهوية ، وخمس مرات على كل فخذ وجانب وطرف. هذا هو المجموع 45 ضربة.
   2. قم بتدوير المسحة برفق أثناء السكتات الدماغية وبينها لضمان التقاط الحمض النووي بشكل فعال. اقسم طرف المسحة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل واحفظها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخراج.
2. استخراج الحمض النووي ومقايسة qPCR
   1. استخرج الحمض النووي الجيني من المسحات عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي المتاح تجاريا مع 30-40 مجم من حبات السيليكا 0.5 مم. تغلبت حبة على العينات في مزيل خلية الخرز بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة. بعد خطوة الخافق الخرزة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 2,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
   2. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، واتركها لتبرد. قم بالطرد المركزي للعينات عند 5,000 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم قم بنقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية سعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى qPCR.
   3. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بعد Boyle et al. 2004 لتحليل حمل العدوى. استخدم التعديلات التالية:
      1. خفف عينات استخراج الحمض النووي 6:100 بماء مزدوج منزوع الأيونات. أضف 0.7 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى كل بئر للمساعدة في منع تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتشغيل كل عينة بشكل فردي. في كل لوحة ، استخدم عنصرا سلبيا (بدون قالب) وتحكم إيجابيا مع سلسلة من معايير التخفيف لتقدير حمل zoospore (العدوى).

< ص الفئة = "jove_title" >3. التلقيح

1. ثقافة دينار بحريني
   1. قم بإعداد مرق الاستزراع بإضافة 16 جم من التربتون ، و 2 جم من تحلل الجيلاتين المائي ، و 4 جم من اللاكتوز (TGHL) إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) واترك المرق يبرد.
   2. تلقيح عزل Bd (في هذه الحالة ، معزول من عزل نيو ساوث ويلز ، AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1 ، رقم الممر 11) في مرق TGHL وينمو لمدة 7 أيام عند 23 درجة مئوية ، ثم انقل ثقافة المرق إلى ألواح أجار TGHL.
   3. لعمل الأطباق ، أضف 16 جم من التربتون ، و 2 جم من تحلل الجيلاتين المائي ، و 4 جم من اللاكتوز (TGHL) ، و 10 جم من الأجار البكتريولوجي إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة). بمجرد أن يبرد الخليط بدرجة كافية للمس ، ولكن قبل أن يتجمد ، اسكب أجار TGHL في ألواح ثقافة قطرها 92 مم بحيث تكون ممتلئة من 1/4 إلى 1/3 ، في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
   4. عندما يتجمد الأجار ويبرد تماما ، قم بتلقيح كل طبق ب 0.5 مل من Bd من المرق السائل ، ووزع بالتساوي. اترك خليط مرق Bd يجف على طبق لمدة 1 ساعة تقريبا ثم أغلق الأطباق بغشاء البارافين البلاستيكي. احتضان جانب أجار لأسفل عند 23 درجة مئوية لمدة 5-7 د.
2. ألواح الفيضانات لمحلول تلقيح الأبواغ الحيوانية
   1. تحقق من حركة zoospore تحت المجهر الضوئي المقلوب لضمان الجدوى يوميا قبل التلقيح. عندما يكون إطلاق الأبواغ الحيوانية مرتفعا ، حيث تسبح العديد من الأبواغ الحيوانية خارج الأبواغ ، تكون الثقافة جاهزة للتلقيح.
   2. غمر كل طبق ب 3 مل من ماء الصنبور القديم أو مياه البركة الاصطناعية ، عن طريق صب الماء في الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للأبواغ الحيوانية بالانطلاق في الماء. بعد فترة الحضانة ، صب معلق zoospore في حاوية معقمة جديدة.
   3. تقدير تركيز الأبواغ الحيوانية باتباع تعليمات الشركة المصنعة باستخدام مقياس كثافة الدم. بمجرد معرفة تركيز معلق zoospore ، قم بتخفيف التعليق إلى تركيز 1 × 10⁶ zoospores لكل 3 مل بماء الصنبور القديم.
3. تلقيح
   1. قم بتلقيح كل عن طريق سكب 3 مل من خليط اللقاح على المخزن في حاويات فردية سعة 50 مل. اسمح للتلقيح الزائد بالتجمع في قاعدة حاوية التلقيح. اترك كل في حاوية تلقيح فردية لمدة 24 ساعة لضمان العدوى ، وبعد التلقيح لمدة 24 ساعة ، أعد كل فرد إلى تررم مطهر.
      1. قم بتطهير التضاريس باستخدام محلول مبيض تجاري بنسبة 13٪ من الحجم / الحجم (حجم / حجم) ، واشطفه مرتين على الأقل بالماء ، ثم اتركه حتى يجف لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
   2. بالنسبة للضوابط السلبية ب ، قم بتلقيح باستخدام نفس الطرق كما في 3.2 - 3.3 ، ولكن قم بإغراق ألواح الأجار الخالية من Bd ب 5 مل من ماء الصنبور القديم بدلا من ألواح الأجار الملقحة ب Bd.

4. Caspase 3/7 الفحص

1. اجمع أطراف أصابع القدم من كل (متعرض لمرض الدماغ وسلبي BD) مرة واحدة أسبوعيا حتى الأسبوع 3 بعد التلقيح ، وكل أسبوعين حتى نهاية التجربة ، حتى 8 أصابع لكل فرد.
   1. اقطع طرف إصبع القدم عند الكتائب الثانية بمقص معقم باللهب ، وضعه في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل ، ثم جمده على الفور عند -80 درجة مئوية.
2. استخرج البروتينات من عينة إصبع القدم المجمدة.
   1. ضع العينات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (25 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7 ، 5 ملي مولار MgCl₂) مع حبتين من الفولاذ المقاوم للصدأ (3.2 مم) في أنبوب صغير ذو غطاء لولبي سعة 1.5 مل. عينات Lyse ب 4 دورات من 1 دقيقة خفق الخرزة بأقصى سرعة (في نفس مضرب الخرزة كما هو مستخدم في الخطوة 1.2.1) متبوعا ب 3 دقائق على الجليد. بعد التحلل ، عينات أجهزة الطرد المركزي عند 12,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. اجمع المادة الطافية لاستخدامها في الفحص.
3. حدد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام مقايسة برادفورد.
   1. في طبق 384 بئر ، اخلطي 10 ميكرولتر من مستخلص البروتين مع 10 ميكرولتر من كاشف برادفورد ، واحتضنيه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء كل عينة مكررة ، جنبا إلى جنب مع سلسلة من معايير تخفيف BSA 5 أضعاف. اقرأ الامتصاص عند 595 نانومتر على قارئ لوحة الامتصاص.
4. بدلا من ذلك ، إذا كانت عينات طرف إصبع القدم صغيرة جدا (يكون تركيز البروتين بالقرب من أدنى مستوى كما هو محدد من اختبار برادفورد أو إذا كانت الضفادع التي تم أخذ عينات منها أقل من 3 جرام من الوزن الإجمالي) ، فقم بتوحيد العينات عن طريق تقدير مساحة سطح الجلد باستخدام الصور الفوتوغرافية ، بدلا من مقايسة برادفورد.
   1. قبل استخراج البروتينات من العينة لمقايسة الكاسباز ، قم بتصوير كل إصبع بالقدم بتكبير 40X باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.
   2. تحليل عينة إصبع القدم باستخدام برنامج التصوير بالكمبيوتر ، من خلال تقدير مساحة إصبع القدم. افعل ذلك عن طريق رسم خط حول حافة مشبك إصبع القدم ، واجعل برنامج التصوير يقدر المنطقة داخل الشكل. ثم اضرب تلك المنطقة في pi (3.14) ، والتي ستقارب مساحة سطح عينة الجلد ثلاثية الأبعاد (حيث يعطي الطول × مساحة المقطع العرضي (pi × القطر) مساحة السطح الخارجي للأنبوب).
5. قم بإجراء اختبار caspase 3/7.
   1. في لوح تلألؤ 384 بئر ، أضف 10 ميكرولتر من كاشف الكاسباز 3/7 المتاح تجاريا و 10 ميكرولتر من مستخلص البروتين. قم بتشغيل كل عينة ثلاث نسخ.
   2. امزج الكواشف عن طريق رج اللوحة ببطء لمدة 15 ثانية. احتضن اللوحة بعيدا عن الضوء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بقياس اللمعان باستخدام قارئ لوحة مضيئة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بولارستار أوميغا بي إم جي لابتك قارئ لوحة مضيئة 384 بئر مسطحة صفيحة سفلية واضحة كورنينج 3707 384 بئر شفة منخفضة بيضاء مسطحة صفيحة كورنينج 3570 أجار البكتريولوجية (الأكسدة) صياد OXLP0011B مرق اللاكتوز (الأكسويد) صياد OXCM0137B بيكربونات الصوديوم صياد بي ت 328-500 تريكين-إس (MS-222) صياد NC0872873 التربتون صياد بي ت 1421-500 ألبومين مصل الأبقار إنفيتروجين 15561020 مسحة الحرير الصناعي المعقمة الأسلاك والمعدات الطبية ميغاواط -113 كاشف كوماسي برادفورد ثقب هاتف: 23200 كاسباز جلو 3/7 بروميجا G8090 عازلة HEPES سيجما ألدريتش H0887-20 مل كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش هاتف: 1374248-1 جرام جيلاتين متحلل إنزيمي سيجما ألدريتش جي 0262 PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.2 (1X) حراري / حياة 20-012-043 بريبمان حراري / حياة 4318930 TaqMan سريع متقدم ماستر ميكس ثيرموفيشر 4444556 مبيض كلوركس كلوركس الإيثانول ، 200 دليل ، درجة جزيئية صياد BP2818500 ZEISS Axio مسح الفلورسنت كارل زايس مجهر فلورسنت 3.2 مم حبات الفولاذ المقاوم للصدأ المواصفات الحيوية هاتف: 11079132SS التمهيدي ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) تقوس تصميم فردي للبادئات والمسبار التمهيدي 5.8S Chytr (5 ′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3 ′) تقوس تصميم فردي للبادئات والمسبار مسبار موثق الأخدود الصغير Chytr MGB2 (5 ′-CGAGTCGAAC-3 ′) تقوس تصميم فردي للبادئات والمسبار أدوات qPCR الجين الدوار كياجين آلة qPCR أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل صياد 02-681-372 صفائح بتري لزراعة الخلايا نونك 263991 حبة صغيرةBeater الزركورنيا-سيليكات الخرز ، 0.5 مم المواصفات الحيوية هاتف: 11079105Z