مقايسة البلعمة: تقنية تلغيم مناعي لتصور ابتلاع الخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية ذبابة الفاكهة السوداء

الملخص

المصدر: Nonaka, S. et al. فحص البلعمة للخلايا المبرمجة في أجنة ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ مناعي لتصور ابتلاع الخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية المتجانسة ذبابة الفاكهة السوداء. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على فسيولوجيا الخلايا من خلال تحديد مدى ابتلاع الخلايا المبرمجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة < ص = "jove_title" >1. تلطيخ الخلايا الدموية

1. تلطيخ مناعي بجسم مضاد مضاد للكرومورت
   1. نقع الشرائح الزجاجية بشكل متسلسل في الميثانول لمدة 10 دقائق ، في PBS تحتوي على 0.2٪ (حجم حجم / حجم) Triton X-100 لمدة 10 دقائق ، ثم في PBS لمدة 10 دقائق.
   2. قم بتركيب 20 ميكرولتر من مصل الخنازير الكامل بنسبة 5٪ (حجم / حجم) في PBS يحتوي على 0.2٪ (حجم / حجم) Triton X-100 على الخلايا للحظر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
   3. قم بإزالة المحلول من الشرائح الزجاجية ، وقم بتركيب 20 ميكرولتر من مصل مضاد Croquemort (0.1٪ (حجم / حجم)) في PBS يحتوي على 0.2٪ (حجم / حجم) Triton X-100 على الخلايا. احتضن الشرائح عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   4. انقع الشرائح الزجاجية في PBS التي تحتوي على 0.2٪ (حجم حجم / حجم) Triton X-100 لمدة 10 دقائق 5 مرات.
   5. انقع الشرائح الزجاجية في PBS لمدة 10 دقائق.
   6. قم بتركيب 20 ميكرولتر من IgG المضاد للفئران المسمى بالفوسفاتيز القلوي (0.5٪ (حجم / حجم)) في PBS يحتوي على 0.2٪ (حجم / حجم) Triton X-100 و 5٪ (حجم / حجم) مصل الخنازير الكامل على الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
   7. انقع الشرائح الزجاجية في PBS التي تحتوي على 0.2٪ (حجم حجم / حجم) Triton X-100 لمدة 10 دقائق 5 مرات.
   8. انقع الشرائح الزجاجية في مخزن مؤقت يحتوي على 100 ملي من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 9.5 ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم 2 لمدة 10 دقائق.
   9. محلول ركيزة الفوسفاتيز الجبل الذي يحتوي على 0.23 مجم / مل 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP) ، 0.35 مجم / مل نيترو أزرق تيترازوليوم (NBT) ، 100 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 9.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي مللي كلوريد_{الصوديوم 2} على الخلايا.
   10. راقب الخلايا تحت المجهر للتلوين المناسب. عندما تظهر إشارات أرجوانية قوية في حبيبات الخلايا الدموية ، قم بإزالة محلول الركيزة ، وانقع الشرائح الزجاجية في مخزن مؤقت يتكون من 10 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.5 ، و 1 ملي مولار EDTA. يوصى بالتلوين لمدة 5 - 10 دقائق تقريبا.

2. تلطيخ الخلايا المبرمجة بواسطة TUNEL

1. انقع الشرائح الزجاجية في PBS لمدة 5 دقائق.
2. كرر مع PBS الجديد.
3. قم بتركيب المخزن المؤقت للتوازن (انظر جدول المواد) على الخلايا لمدة 10 دقائق.
4. قم بإزالة المحلول من الشرائح الزجاجية ، وقم بتركيب 20 ميكرولتر من محلول TdT الذي يحتوي على 5 ميكرولتر من ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز طرفي و 15 ميكرولتر من عازلة التفاعل على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
5. قم بإزالة المحلول من الشرائح الزجاجية ، وانقع الشرائح في مخزن مؤقت يتكون من 0.5 مل من عازلة STOP / Wash و 17 مل من الماء.
6. انقع الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق 3 مرات.
7. قم بتركيب 20 ميكرولتر من Anti-Digoxigenin-Peroxidase على الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. انقع الشرائح الزجاجية في PBS لمدة 5 دقائق 4 مرات.
9. نقع الشرائح الزجاجية في محلول ركيزة بيروكسيداز يتكون من 30 مل من 50 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 التي تحتوي على ملعقة دقيقة كاملة من 3،3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB) ، و 0.002٪ (حجم / حجم) H₂O₂ لمدة 30 ثانية.
10. كرر الخطوة المذكورة أعلاه حتى تتلطخ الخلايا المبرمجة باللون البني. انقع الشرائح الزجاجية في الماء لإيقاف تفاعل البيروكسيداز.
11. إحاطة الخلايا بالماء للمراقبة.

< p class = "jove_title">3. قياس مستوى البلعمة في الخلايا المبرمجة

1. راقب العينات تحت المجهر الضوئي لتقييم مستوى البلعمة. عد الخلايا الإيجابية للكروكيمورت أو الخلايا الإيجابية ل GFP على أنها خلايا دموية ، والخلايا الإيجابية TUNEL كخلايا موت الخلايا المبرمج ، والخلايا الإيجابية المزدوجة على أنها خلايا دموية بلعمة.
2. يعرف مؤشر البلعمة بأنه عدد الخلايا الإيجابية المزدوجة إلى العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية أو الخلايا الإيجابية ل GFP. يوصى بملاحظة أكثر من 300 خلية دموية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الخنازير الكامل MP الطب الحيوي 55993 للحظر Kpl مكافحة الفئران IgG (H + L) AB MSA ، AP KPL 475-1612 الجسم المضاد الثانوي للخلايا الدموية الصبغية مع الجسم المضاد المضاد للكرومورت 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-فوسفات روش 11383221001 BCIP ، لتلوين الخلايا الدموية نيترو بلو تيترازوليوم روش 11383213001 NBT ، لتلوين الخلايا الدموية الأجسام المضادة المضادة للكرومورت الموصوف سابقا في Manaka et al، J. Biol. Chem.، 279، 48466-48476 طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج في الموقع Apop Tag Peroxidase ميليبور S7100 لتلوين خلايا موت الخلايا المبرمج. تتضمن هذه المجموعة المخزن المؤقت للتوازن ، والمخزن المؤقت للتفاعل ، والمخزن المؤقت STOP / Wash ، وإنزيم TdT ، ومضاد للديجوكسيجينين بيروكسيداز. 3،3'-ديامينوبنزيدين رباعي هيدري كلوريد ناكالاي تيسكي 11009-41 DAB ، لتلوين خلايا موت الخلايا المبرمج