مقايسة كثرة الخلايا الثابتة: طريقة لدراسة امتصاص الخلايا المبرمجة للخلايا المبرمجة بواسطة البلاعم باستخدام الفحص المجهري الفلوري

الملخص

المصدر: Taruc، K.، et al. القياس الكمي للكثرة عن طريق الفحص المجهري الفلوري أحادي الخلية. J. Vis. إكسب. (2018).

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة كثرة الخلايا المبرمجة لدراسة إزالة الخلايا المبرمج باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. كثرة الخلايا المبرمجة هي عملية متعددة الخطوات حيث تبتلع الخلايا المبرمجة الخلايا البلعمية وتتحلل داخل حويصلات تسمى الجلد. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتصور الأجزاء الداخلية وغير الداخلية من الخلايا المبرمج الفردية وتحديد كتب الخلايا المبرمجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

فئة

1. ثقافة وإعداد خط خلية الخلية الأحادية THP-1

1. استزراع الخلايا الوحيدة THP-1 كثقافة معلقة في قوارير T25 عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. يجب زراعة الخلايا في 5 مل من معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI 1640) + 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS).
2. كل يوم ، قم بتعليق الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء وسط النمو عن طريق هز القارورة برفق ، ثم عد الخلايا على الفور باستخدام مقياس كثافة الدم. يجب تمرير الخلايا بمجرد أن تصل كثافة الخلية إلى 1 × 10⁶ خلايا / مل:
   1. RPMI 1640 + 10٪ FBS دافئ مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. انقل 2 × 10⁵ خلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل أو أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل (أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل) أو 5 مل (أنبوب مخروطي 15 مل) من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   4. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   5. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من RPMI 1640 + 10٪ FBS.
   6. في قارورة T25 جديدة ، ضع 4 مل من الوسائط الدافئة ، وأضف إلى ذلك الخلايا المعلقة من 1.2.5. زراعة في حاضنة 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تتطلب الخلايا المرور (عادة 3 أيام) ، أو حتى تكون الخلايا مطلوبة للتجربة.
3. لتجربة البلاعم المشتقة من THP-1 ، قم بإزالة العدد المطلوب من الخلايا من القارورة واللوحة قبل المرور:
   1. ضع العدد المطلوب من أغطية الزجاج الدائرية مقاس 18 مم (# 1.5 سمك) في آبار صفيحة 12 بئرا - عادة 1 غطاء لكل حالة و / أو نقطة زمنية. في كل بئر aliquot 5 × 10⁴ THP-1 أحاديات الخلايا. يمكن تغيير عدد الخلايا المضافة إلى كل بئر إذا لزم الأمر.
   2. ارفع الحجم الإجمالي لكل بئر يحتوي على خلية إلى 1 مل باستخدام RPMI + 10٪ FBS الدافئ إلى 37 درجة مئوية.
   3. أضف 100 نانومتر فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) إلى كل بئر وثراعة لمدة 3 أيام للحث على تمايز الخلايا الوحيدة THP-1 إلى خلايا شبيهة بالبلاعم.

< p class = "jove_title" >2. ثقافة وإعداد خط خلية البلاعم J774.2

1. زراعة خلايا J774.2 في قوارير T25 عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. يجب زراعة الخلايا في 5 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10٪ FBS وتمريرها بمجرد أن تصل الثقافة إلى 80-90٪ من التقاء. لتمرير الخلايا:
   1. قم بإزالة جميع الوسائط من القارورة وارتفع مرة واحدة باستخدام 5 مل من PBS.
   2. قم بإزالة PBS من القارورة واستبدلها ب 5 مل من DMEM الطازج + 10٪ FBS.
   3. باستخدام مكشطة الخلية ، اكشط الجزء السفلي من القارورة لتعليق الخلايا في الوسائط. قم بماصة الخلايا بقوة عدة مرات لتفتيت أي مجاميع خلوية.
   4. قم بتخفيف الخلايا 1: 5 عن طريق إزالة 4 مل من تعليق الخلية من القارورة واستبدالها ب 4 مل من الوسائط الجديدة. يمكن التخلص من معلق الخلية المتبقي ، أو استخدامه لبدء زراعة خلية جديدة في قارورة T25 جديدة ، أو استخدامها في التجربة.
2. لإعداد مقايسة كثرة الخلايا باستخدام خلايا J774.2:
   1. قبل يوم واحد من بدء التجربة ، قم بتعليق خلايا J774.2 في 5 مل من الوسائط الجديدة ، وفقا للخطوات 1.1.1-1.1.3. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وإعداد الحجم اللازم من الخلايا بتركيز 5 × 10⁴ خلايا / مل.
   2. ضع العدد اللازم من أغطية الزجاج الدائرية مقاس 18 مم (سمك # 1.5) في آبار صفيحة 12 بئرا. في كل بئر aliquot 1 مل من 5 × 10⁴ خلايا / مل تعليق الخلية.
   3. استزراع بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق بالغطاء والتعافي من المرور.

3. ثقافة البلاعم البشرية الأولية M2

1. اجمع 10 مل من دم الإنسان الهيباريني لكل صفيحة 12 بئرا من البلاعم M2 المطلوبة.
2. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، طبقة 5 مل من دم الإنسان فوق 5 مل من وسط فصل الخلايا اللمفاوية المتعددة الدافئة مسبقا. قم بإعداد أنابيب متعددة في حالة معالجة >5 مل من الدم بدلا من استخدام أنابيب أكبر حجما.
3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 35 دقيقة ، باستخدام تسارع متوسط وبدون انقطاع.
4. قم بإزالة الشريط العلوي الغني بالخلايا أحادية النواة بعناية باستخدام ماصة بلاستيكية وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. إذا تم تحضير أنابيب متعددة في الخطوة 3.2 ، فيمكن تجميع النطاقات في أنبوب واحد سعة 50 مل. ارفع حجم الأنبوب إلى 50 مل مع PBS.
5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 8 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. خلال هذه الخطوة ، ضع أغطية دائرية بقطر 18 مم (سمك # 1.5) في كل بئر من صفيحة 12 بئر.
6. إعادة تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من RPMI 1640 الخالي من المصل لكل عدد مطلوب من الآبار ؛ على سبيل المثال ، إذا تمت معالجة 10 مل من الدم لإعداد طبق كامل مكون من 12 بئرا ، فقم بتعليق حبيبات الخلية في 3.6 مل من الوسائط.
7. أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر يحتوي على غطاء في اللوحة المكونة من 12 بئرا. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
8. اغسل الغطاء برفق 3 مرات مع 1 مل من PBS الدافئ لإزالة أي خلايا غير ملتصقة.
9. أضف 1 مل من RPMI 1640 + 10٪ FBS + 10 نانوغرام / مل M-CSF البشري المؤتلف + مضاد حيوي / مضاد للفطريات. احتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 أيام.
10. استبدل الوسائط ب RPMI 1640 + 10٪ FBS + 10 نانوغرام / مل M-CSF البشري المؤتلف + 10 نانوغرام / مل IL-4 البشري المؤتلف + مضاد حيوي / مضاد للفطريات. احتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين لإكمال استقطاب M2.
11. يجب استخدام البلاعم المستقطبة في غضون الأيام الثلاثة القادمة.

4. تحضير خلايا Jurkat المبرمج

1. زراعة خلايا Jurkat في 5 مل من RPMI 1640 + 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. Jurkats عبارة عن خط خلوي معلق ويمكن الحفاظ عليه عن طريق تمرير 1: 5 إلى وسائط جديدة ودافئة مسبقا كل 3-5 أيام.
2. لتحضير الخلايا موت الخلايا المبرمج ، اسمح لثقافة Jurkat بالنمو إلى كثافة عالية (4-5 أيام بعد المرور). Aliquot 1.5 مل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط RPMI 1640 الخالي من المصل الذي يحتوي على 1 ميكرومتر من الستاوروسبورين.
4. احتضان 16 ساعة عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لجعل الخلايا موت الخلايا المبرمجة.
5. إذا رغبت في ذلك، تأكد من تحريض موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ الملحق الخامس:
   1. Aliquot 100 ميكرولتر من زراعة خلايا Jurkat المعالجة بالستاروسبورين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق, تخلص من المادة الطافية, وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الخالي من المصل.
   2. أضف 1 ميكرولتر من الملحق الخامس المترافق بالفلورسين (FITC) واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   3. أضف 900 ميكرولتر من PBS وانقل الحجم بالكامل إلى بئر واحد من صفيحة 12 بئرا تحتوي على غطاء زجاجي دائري مقاس 18 مم (سمك # 1.5). قم بالدوران في جهاز طرد مركزي مزود بمحول لوحة عند 200 × جم لمدة 1 دقيقة لإجبار الخلايا على الالتصاق بالغطاء. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الخلايا في شريحة حجرية للتصوير.
   4. الصورة باستخدام المجهر الفلوري.

< p class = "jove_title" >5. قياس امتصاص الخلايا المؤثرة وديناميكيتها باستخدام مقايسة كثرة الخلايا الثابتة والتلوين من الداخل إلى الخارج

1. قم بإعداد البلاعم البشرية THP-1 أو J774.2 أو M2 كما هو موضح في الأقسام 1-3 ، على التوالي.
2. في الليلة التي تسبق بدء التجربة ، قم بإعداد خلايا Jurkat موت الخلايا المبرمج كما هو موضح في القسم 4.
3. قبل التجربة مباشرة ، قم بحساب الخلايا المبرمجة باستخدام مقياس كثافة الدم. انقل أعدادا كافية من الخلايا المبرمجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل - نضيف عادة 5 × 10⁵ خلايا / بئر ، مما يوفر هدفا: نسبة الخلايا المؤثرة 10: 1.
4. خلايا بيليه جوركات عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقها في 500 ميكرولتر من PBS.
5. أثناء الطرد المركزي ، قم بنقل 10 ميكرولتر من DMSO في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. قم بإذابة كمية قليلة من N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) في DMSO. 5-10 بلورات (~ 0.005 مجم) كافية.
6. انقل معلق الخلايا المبرمج / PBS سعة 500 ميكرولتر إلى الأنبوب المحتوي على البيوتين DMSO / NHS. ثم قم بتخفيف صبغة تتبع الخلايا إلى التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة في تعليق الخلايا المبرمجة. تأكد من تحديد صبغة تتبع الخلايا التي لا تتداخل طيفيا مع FITC-Streptavidin (مثل صبغة تتبع الخلايا الحمراء أو الحمراء البعيدة).
7. احتضن التعليق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف حجما متساويا من RPMI 1640 + 10٪ FBS واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لإخماد أي صبغة غير متفاعلة.
8. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا المبرمج الملطخة في 100 ميكرولتر من RPMI 1640 + 10٪ FBS لكل بئر من الضامة.
9. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا المبرمج الملون بالتنقيط إلى كل بئر من البلاعم. جهاز طرد مركزي 200 × جم لمدة 1 دقيقة في جهاز طرد مركزي مزود بمحول لوحة لفرض الاتصال بين البلاعم والخلايا المبرمجة.
10. احتضان اللوحة للفترة الزمنية المطلوبة عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة زراعة الأنسجة. بالنسبة للبلاعم ، عادة ما تكون المواد المفعمة بالخلايا قابلة للكشف لأول مرة بعد 20-30 دقيقة ، ويتم اكتمالها بعد 120-180 دقيقة.
11. في النقطة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة. اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة لوقف كثرة الخلايا المبرمجة وإزالة الخلايا المبرمجة غير المفعمة.
12. أضف الستربتافيدين المترافق ب FITC عند تخفيف 1: 1,000 لكل بئر واحتضانه لمدة 20 دقيقة في الظلام. سيؤدي هذا إلى تسمية البيوتين المكشوف على أي مادة خلية موت الخلايا المبرمج غير المفعمة.
    ملاحظه: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تلطيخ نوى الخلية خلال هذه الخطوة عن طريق إضافة 1: 20،000 تخفيف من Hoechst 33342 أو 4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI).
13. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 1 مل PBS ، مع رج العينات برفق أو هزها لمدة 5 دقائق لكل شطف. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة PFA الزائد.
14. قم بتركيب أغطية على شريحة للتصوير ونقلها إلى المجهر الفلوري. التقط مجموعات z-stacks لعدد كاف من الخلايا للقياس الكمي الدقيق - عادة 10-30 خلية لكل حالة. ستظهر مادة الخلايا المبرمج غير الداخلية في الصورة الناتجة كمادة تحمل علامة صبغة تتبع الخلايا مغلفة بتلطيخ FITC-streptavidin ، بينما تشكل المواد المبرمجة للخلايا صبغة منفصلة لتتبع الخلايا خالية من أي تلطيخ ستربتافيدين.
15. تحديد كثرة الارتياح في الصور الناتجة من خلال مجموعة متنوعة من المقاييس:
    1. احسب مؤشر efferocytic عن طريق تحديد متوسط عدد المركبات المنفصلة (صبغة تتبع الخلايا + / streptavidin- puncta) لكل ضامة. حدد فقط البلاعم المرتبطة بخلية موت الخلايا المبرمج أو التي تحتوي على ≥1 من الفجومات المرئية. سجل البلاعم المرتبطة بخلية موت الخلايا المبرمج ، ولكنها تفتقر إلى الجسيمات المنفصلة ، حيث تحتوي على مؤشر efferocytic يبلغ 0.
    2. احسب كفاءة الخلايا الفعلي عن طريق قياس جزء الضامة التي تحتوي على ≥1 جسيم فوري.
    3. احسب معدل كثرة الخلايا عن طريق تصوير الخلايا الثابتة والملطخة في نقاط زمنية متعددة. فقط البلاعم للصور المرتبطة بالخلايا المبرمج ، أو التي تحتوي على جسيمات موجزة مرئية ، مع التقاط مكدسات z لكل خلية. بمجرد التصوير ، حدد معدل كثرة الكريات:
       1. باستخدام تلطيخ الستربتافيدين كدليل ، وأداة اختيار اليد الحرة أو المضلع في FIJI / ImageJ (أو حزمة برامج تحليل الصور الأخرى) ، ضع دائرة حول كل صبغة تتبع الخلية + / ستربتافيدين (على سبيل المثال داخلية) المواد في مستوى واحد من z-stack. قم بقياس الكثافة المتكاملة لصبغة تتبع الخلايا في هذه المنطقة. يمكن بسهولة الحصول على المقاييس الفردية لكل سويم (مثل القطر ، وتحديد المواقع بالنسبة لحدود الخلية أو النواة ، وما إلى ذلك) في وقت واحد مع هذه القياسات ، مما يزيد بشكل كبير من البيانات التي تم جمعها أثناء التحليل.
       2. في نفس القسم z ، باستخدام تلطيخ الستربتافيدين كدليل وأداة الاختيار اليدوية أو المضلعة ، ضع دائرة حول كل صبغة تتبع الخلايا + / ستربتافيدين + (على سبيل المثال غير داخلية) في مستوى واحد من المكدس z. تشمل فقط تلطيخ الخلايا المبرمجة الملامسة للخلايا البلعمة. قياس الكثافة المتكاملة لهذه المنطقة.
       3. كرر الخطوات 4.2.3.1 إلى 4.2.3.2 للأقسام z المتبقية من الصورة. مجموع الكثافة المتكاملة للمواد المفعمة بالخلايا (Σ_eff) وغير المؤثرة (Σ_ne). يمكن حساب جزء الخلية المبرمج الذي تم إفخاله للخلية على النحو التالي:
          
       4. حدد الكسر الناتج عن الخلايا لجميع الخلايا في جميع النقاط الزمنية. لاحظ أن شدة الفلورسنت للخلايا / الجسيمات المبرمجة يمكن أن تختلف بين الصور بسبب الاختلافات في امتصاص أصباغ تتبع الخلايا بواسطة الخلايا المبرمجة الفردية ، وبسبب التغيرات في معلمات الحصول على الصور مثل وقت التعرض. على هذا النحو ، قارن فقط القيم الطبيعية مثل الكسر Efferocytosed ، أو القيم المستقلة عن الشدة مثل مؤشر efferocytic والكفاءة efferocytic ، بين الصور ، بين الظروف التجريبية ، وبين تكرار التجارب.
    4. للتأكد من أن مجموعة البيانات الناتجة تعكس بدقة التباين في كثرة الخلايا بين الخلايا ، قم بإجراء هذه التحليلات على الحد الأقصى لعدد الخلايا الممكن في كل تجربة.
       ملاحظه: يمكن حساب الكفاءة efferocytic ومؤشر الخلايا efferocytic بسرعة (بضع ثوان / خلية) ، ونهدف عادة إلى تحليل ما لا يقل عن 100 خلية لكل تجربة ، وتكرار كل تجربة 3 مرات على الأقل. يعد حساب جزء المادة المفعمة بالخلايا ، والمقاييس الخاصة بالجسيمات الأكثر صعوبة ، وعادة ما تستغرق 2-3 دقائق / خلية لمحلل متمرس. بالنسبة لهذه الحسابات ، نحدد ما لا يقل عن 15 خلية لكل حالة ، لكل تجربة.
    5. سجل مؤشر الخلايا الفعلي ، وكسر الخلايا ، وبيانات الفويرة الفردية على أساس كل خلية.
       ملاحظه: يسمح هذا بتحليل البيانات باستخدام مناهج الخلية الواحدة ، مما يسمح بقياس الاختلافات بين الخلايا. لا يزال من الممكن إجراء تحليلات على مستوى السكان على مجموعات البيانات هذه من خلال حساب متوسط بيانات الخلية المفردة التي تم الحصول عليها في التجارب الفردية. يمكن تحليل القياسات الخاصة بالفلوروسوم على مستوى السكان ، ومستوى الخلية المفردة ، وكمجموعات (على سبيل المثال كمجموعات من الجسيمات المفرطة المستقلة عن الخلايا التي تحتوي عليها).

المواد