اختبار مراسل البويضة المفردة في المختبر: تقنية لدراسة تنظيم ترجمة الرنا المرسال المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر

الملخص

المصدر: Costermans، N.G.J. et al.، تحديد برنامج ترجمة الرنا المرسال للأمهات أثناء النضج في المختبر باستخدام مقايسة مراسل البويضة الواحدة. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نوضح أنه في وجود مثبط فوسفوديستر ، يتم إيقاف دورة خلية البويضة عند الطور الأول ، حيث يتم تخزين mRNAs المنسوخة في حالة عدم وجود ترجمة. بعد إطلاق المثبط ، يستأنف نضج البويضات ، وتدخل الخلايا في الطور. تشير إشارة الرنا المرسال للمراسل المدمجة مع الجين المستهدف في الطور الأول إلى تنشيط الآلية الانتقالية والتعبير عن البروتين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد الوسائط

1. أضف جميع المكونات ، كما هو موضح في الجدول 1 ، لجعل وسط جمع البويضات الأساسي ووسط نضج البويضات. بالنسبة لوسط التجميع الأساسي ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. لكل من وسط التجميع والنضج ، أضف 3 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 1 ميكرومتر من سيلوستاميد في يوم الاستخدام.

فئة

2. تحضير ترميز mRNA ل Ypet-3 'UTR و mCherry

1. احصل على تسلسلات UTR 3 من mRNAs ذات الاهتمام.
   ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم الحصول على التسلسلات مسبقا من بويضات الفئران cDNA.
2. صمم بادئات لتضخيم UTRs المستهدفة 3 'من (كدنا) للبويضة وأجزاء من متجه pcDNA 3.1 الذي يحتوي على تسلسل ترميز Ypet وعلامة V5-epitope ومحفز T7.
3. قم بالتضخيم باستخدام مجموعة بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة. قم بتشغيل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على مادة هلامية للتحقق مما إذا كانت الشظايا لها الحجم الصحيح ، وقطع الأربطة ، واستخراج الحمض النووي من الجل باستخدام مجموعة استخراج الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. دمج شظايا PCR في ناقل باستخدام مجموعة استنساخ PCR.
   ملاحظه: تم تحضين شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد لمدة 4 ساعات لتسهيل عملية إعادة التركيب بشكل أكثر كفاءة. هذا يتعارض مع تعليمات الشركة المصنعة ، والتي توصي بوقت حضانة يبلغ 45 دقيقة فقط.
5. شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل الشفافة إلى بكتيريا الإشريكية القولونية المختصة 5-α.
   1. أضيفي المزيج والبلازميد إلى البكتيريا ، وحتضنيه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
   صدم
   2. المزيج والبلازميد بالحرارة عن طريق وضع الخليط في حمام مائي على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم يبرد على الفور على الثلج لمدة 3 دقائق.
   3. أضف 500 ميكرولتر من مرق Super Optimal مع وسط قمع الكاتابوليت (SOC) واحتضنه لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بالدوران عند 7000 × جم لمدة دقيقتين ، ثم قم بإزالة معظم المادة الطافية. أعد تعليقها ووضعها على طبق أجار مرق لوريا (LB) مع المضاد الحيوي المناسب للاختيار.
      ملاحظه: تم استخدام كاربينيسيلين في هذه الدراسة.
   5. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اعزل المستعمرات عن طريق الضغط برفق على طرف الماصة على إحدى المستعمرات ووضعها في 3 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام / مل من الكربنيسيلين. احتضان لمدة 12-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   6. استخرج الحمض النووي للبلازميدات باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتأكد من التسلسلات عبر تسلسل الحمض النووي.
6. ل Ypet / 3 'UTR:
   1. إنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر. استخدم برايمر أمامي في المنبع من تسلسل Ypet وبرايمر عكسي مع 20 بقايا ثايمين إضافية. انظر الجدول 2 للاطلاع على تسلسل Ypet / IL-7 3 'UTR وتسلسلات الاشعال الأمامية والعكسية.
      ملاحظه: ستضيف بقايا الثايمين الإضافية هذه oligo (A) إلى mRNA الخطي بعد النسخ في المختبر.
   2. قم بنسخ منتج PCR في المختبر باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. قم بتنقية الحمض النووي الريبي التكميلي الناتج (cRNA) باستخدام مجموعة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   4. قم بإزالة الحمض النووي الريبي النقي في الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، وقياس التركيز ، وتقييم السلامة عن طريق الرحلان الكهربائي للأغروز. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
7. ل mCherry:
   1. أنتج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر باستخدام إنزيم تقييد عالي الدقة؛ استخدم إنزيم التقييد mfEI-HF في حالة تكرار هذا المثال. يهضم في مخزن مؤقت للهضم طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   2. قم بتشغيل مادة هلامية لتنقية العينة ، واستخرج الحمض النووي الخطي باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. قم بنسخ منتج PCR في المختبر باستخدام مجموعة نسخ T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   4. بولي أدينيلات الحمض النووي الريبي (150-200 نيوكليوتيد) باستخدام مجموعة مخلفات بولي (A) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   5. قم بتنقية الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام مجموعة تنظيف النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   6. قم بإزالة الحمض النووي الريبي النقي في الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، وقياس تركيزات الرنا المرسال ، وتقييم سلامة الرسالة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. الإجراء التجريبي

ملاحظة: يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية على الحقن الدقيق للبويضات والفحص المجهري بفاصل زمني لاحق في الشكل 1.

1. اليوم 1
   1. حقن الفئران البالغة من العمر 21 يوما داخل الصفاق مع 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل لتعزيز نمو البصيلات إلى المرحلة الأنفية.
2. اليوم 3
   1. مجموعة البويضات
      1. افتح البصيلات التاجية بعناية عن طريق عمل قطع صغير في جدار المسام بإبرة 26 جراما. عزل البويضات المغلقة بالركام السليمة (COCs) بعدة طبقات من الخلايا الركامية باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم.
      2. استخدم ماصة أصغر (أكبر قليلا من قطر البويضة) ، وقم بنزع الكربون ميكانيكيا عن طريق سحب العينات المتكرر.
         ملاحظه: بدلا من ذلك ، قم بإجراء الحقن الدقيق على COCs السليمة.
      3. باستخدام ماصة أكبر ، قم بشفط البويضات المجردة من النزول وضعها في طبق بتري مع وسط نضج مكمل ب 1 ميكرومتر من مثبط فوسفوديستراز ، سيلوستاميد ، لمنع استئناف النضج الانتصافي. ضع الطبق في الحاضنة لمدة ساعتين للسماح للبويضات بالتعافي من الإجهاد الناجم عن عزل البويضات عن البصيلات.
   2. الحقن الدقيق للبويضات
      1. تحضير إبر الحقن عن طريق وضع أنبوب شعري زجاجي من البورسليكات بطول 10 سم في مجتذب ميكانيكي. للحصول على الحقن الأمثل ، قم بثني طرف الإبرة بزاوية 45 درجة باستخدام خيوط ساخنة.
      2. قم بإعداد أطباق البوليسترين بقطرات 20 ميكرولتر من وسط جمع البويضات الأساسية ، وقم بتغطية القطرات بالزيت المعدني الخفيف.
      3. قم بإعداد مزيج مراسل عن طريق إضافة 12.5 ميكروغرام / ميكرولتر Ypet-3 'UTR و 12.5 ميكروغرام / ميكرولتر مللي كرز. قم بإعداد حجم أكبر وقم بعمل حصصات للتجارب المستقبلية لضمان تركيزات المراسلين المماثلة. قم بتخزين هذه الحصص عند -80 درجة مئوية. عند الذوبان ، قم أولا بجهاز الطرد المركزي للكمية لمدة دقيقتين عند 20,000 × جم ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
         ملاحظه: سيمنع هذا الطرد المركزي إبرة الحقن من الانسداد بسبب الركام المحتمل في مزيج المراسلين.
      4. قم بتحميل إبرة الحقن عن طريق الشعيرات الدموية بحوالي 0.5 ميكرولتر من مزيج المراسل.
      5. ضع الماصة المثبتة وإبرة الحقن المحملة في الحوامل ، وضعها في قطرة وسط تجميع البويضات. استنشق بعضا من الوسط في الماصة الثابتة.
      6. افتح إبرة الحقن عن طريق النقر عليها برفق على الماصة المثبتة.
      7. ضع البويضات في قطرة من وسط التجميع الأساسي ، وحقن 5-10 pL من مزيج المراسل.
      8. احتضان البويضات في وسط النضج باستخدام 1 ميكرومتر من cilostamide لمدة 16 ساعة للسماح لإشارة mCherry بالاستقرار.
      9. قم بإعداد طبق بتري الذي سيتم استخدامه للفحص المجهري بفاصل زمني مع قطرتين على الأقل سعة 20 ميكرولتر من وسط النضج لكل محضر محقن: قطرة واحدة مع 1 ميكرومتر سيلوستاميد للتحكم في البويضات المعقوفة بالطور الأول وقطرة واحدة بدون سيلوستاميد للبويضات الناضجة. غطي القطرات بالزيت المعدني الخفيف وضعيها في الحاضنة.
   3. الفحص المجهري بفاصل زمني
      1. بعد الحضانة المسبقة ، قم بإزالة البويضات المحقونة من الحاضنة ، واغسلها أربع مرات في وسط النضج بدون سيلوستاميد. احتفظ ببعض البويضات في وسط النضج مع 1 ميكرومتر سيلوستاميد كمجموعة تحكم في البويضات المعوقفة بالطور الأول.
      2. انقل البويضات المحقونة إلى قطراتها الخاصة على طبق المجهر بفاصل زمني معد مسبقا. قم بتجميع البويضات باستخدام ماصة زجاجية مغلقة (يمكن تحضير ماصة مغلقة عن طريق تثبيت الطرف في اللهب لبضع ثوان).
         ملاحظه: يساعد تجميع البويضات على منع حركتها أثناء التسجيل.
      3. ضع الطبق تحت المجهر المزود بنظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء ومرحلة آلية مجهزة بغرفة بيئية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. لتكرار هذه الدراسة ، استخدم المعلمات التالية: مجموعة المرشحات: مرآة ثنائية اللون YFP / CFP / mCherry 69008BS ؛ قناة YFP (الإثارة (على سبيل المثال): S500 / 20 × 49057 ؛ البث (EM): D535/30 m 47281), قناة mCherry (مثال: 580/25 × 49829; Em: 632/60 م).
      4. أدخل الإعدادات المناسبة لتجربة اللقطات المتتابعة (راجع جدول المواد للبرامج المستخدمة في هذه الدراسة): انقر فوق التطبيقات | الاستحواذ متعدد الأبعاد. حدد علامة التبويب الأولى رئيسي وحدد اللقطات المتتابعة ومواضع المراحل المتعددة والأطوال الموجية المتعددة.
      5. حدد علامة التبويب حفظ لإدخال الموقع الذي يجب حفظ التجربة فيه.
      6. حدد علامة التبويب اللقطات المتتابعة لإدخال عدد النقاط الزمنية والمدة والفاصل الزمني.
         ملاحظه: تعتمد مدة تجربة الفاصل الزمني على الأنواع الحيوانية المدروسة ، حيث يختلف توقيت نضوج البويضات الانتصافية بين الأنواع. في هذه التجربة مع بويضات الفئران ، تم تسجيل البويضات كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة.
      7. حدد علامة التبويب المرحلة. قم بتشغيل المجال الساطع وحدد موقع البويضات عن طريق فتح نافذة جديدة عن طريق تحديد اكتساب | الاستحواذ | عرض مباشر. بمجرد تحديد موقع البويضات ، ارجع إلى نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد ، واضغط على + لتعيين موقع البويضات.
      8. حدد علامة التبويب الأطوال الموجية ، وقم بتعيين 3 أطوال موجية مختلفة للمجال الساطع (التعريض الضوئي 15 مللي ثانية) ، YFP (التعرض 150 مللي ثانية ل Ypet / IL7 3 'UTR) ، و mCherry (التعرض 75 مللي ثانية ل Ypet / IL7 3 'UTR).
         ملاحظه: اضبط التعرض لكل مراسل Ypet / 3 'UTR بناء على مستوى تراكم المراسل والحجم المحقون. التأكد من أن إشارة YFP تقع في مركز نطاق الكشف في بداية التجربة لمنع التقليل من التقدير أو التشبع في حالة تنشيط الترجمة. بالنسبة إلى mCherry ، اضبط التعرض لكل دفعة من mCherry حيث تعتمد الإشارة على عدد نيوكليوتيدات الأدينين التي تمت إضافتها أثناء إجراء بولي الأدينيل. بسبب الاختلاف في كفاءة polyadenylation ، استخدم نفس الدفعة من mCherry في تجارب مختلفة لمقارنة أفضل بين التجارب.
      9. ابدأ تجربة الفاصل الزمني بالنقر فوق اكتساب. انظر الشكل 1 للحصول على مثال لتسجيل الفاصل الزمني في بويضة واحدة.
   4. تحليل ترجمة Ypet-3 'UTR
      1. لهذا التحليل (انظر جدول المواد للبرنامج المستخدم في هذه الدراسة) ، قم بإجراء قياسين للمنطقة لكل بويضة: البويضة نفسها - انقر فوق منطقة القطع الناقص وتحيط بالبويضة - ومنطقة صغيرة قريبة من البويضة لاستخدامها في طرح الخلفية - انقر فوق منطقة مستطيلة.
         ملاحظه: تأكد من أن البويضات لا تتحرك خارج المنطقة المحددة أثناء تسجيل الفاصل الزمني. انتبه بشكل خاص لوضع قياس المنطقة حول بثق الجسم القطبي ، لأن هذا يسبب حركة في البويضة وقد يشوه التسجيل.
      2. قم بتصدير بيانات قياس المنطقة إلى جدول بيانات بالنقر أولا على فتح السجل ثم على Log Data لتصدير برنامج تحليل البيانات.
      3. لكل بويضة فردية ولجميع النقاط الزمنية المقاسة، اطرح قياس منطقة الخلفية من قياس منطقة البويضة. افعل ذلك للأطوال الموجية YFP و mCherry بشكل منفصل.

الجدول 1: إعداد الوسائط. قائمة المكونات التي يجب إضافتها لإعداد وسط جمع البويضات الأساسي ووسط نضج البويضات.

وسط جمع البويضات الأساسية مكون ل 500 مل معدل HEPES الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي 7.1 جرام بيكربونات الصوديوم 252 مجم بيروفات الصوديوم 1.15 مل البنسلين / الستربتومايسين 100x 5 مل ماء مقطر فائق النقاء (Invitrogen ، 10977-015) حتى 500 مل وسط النضج مكون ل 500 مل MEM ألفا 1x حتى 500 مل بيروفات الصوديوم 1.15 مل البنسلين / الستربتومايسين 100x 5 مل

الجدول 2: مثال على تسلسل المراسل والتمهيدي تسلسل مراسل YFP / IL7 3'UTR وتسلسلات الاشعال الأمامية والعكسية التي تم استخدامها لإنتاج قالب PCR خطي للنسخ في المختبر.

تسلسل Ypet / Interleukin-7 3 'UTR GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGGGCGGGGGCGGCGGCGGCGGGGCGGCGGGGCGAGGGGGCGGGGGGCACCTACGGCAAGCTGACCCTGACCACCGGCAAGCTGCTGGTGGGTCCACCACCGGCAAGCTG
CCCGTGCCCTGGCCCCCACCCTGGTGGACCCTGGGCTACGGCGTGGGTCGTCGTCGTCGGTCGTCGTCGTCCGTCCGACCACCACACACACCACAGCCCATGCCCCCGGGCTACGTGGGGTCGTGCAGGAGCGGACCA
TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGGGGAGGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCTGAACCGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGGGGCTGAAGGGCGACTTCAAGGAGGACCACACATACCTGGG
TACAACTACAACACACACACACACGTGTACATCACCGCCCACAAGCAGAAGAACGGGGCATCAGGCACACACACACACACACACACACACACATACCACACATACGAGGACGGCGGCGTGGCTGGCCACCACTACCAGCACACACACAACACCCCCA
TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCCCCCAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAAGCGGGACCACATGGTGCTGGCTGGTCCTGACCGCCCCGCCGGGGTCTCTCTCTCTCTC br ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTCTCTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATTGAACAGGACATTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT
CATATACTTGGAGAGGTTGAacccttccagaagttcctggatgccctgctcaaataagcccaagcagctgagaaatctacagtgagtgagatggacacagaaatgcagctgactgctgctgctgccgtcagcatata
CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGATTCAGATCACCACTGTGTTTTTTT
AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTGTGTGTGTGTGTTAGACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAG
CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTTAAAAAAGTTTTTAAAGATAGAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA
ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTTTAATTTTGGCATTCTGTCTCTCT
CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATATATATATATATATATATATTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACACTGTGTCAGGTTCCCTTCTCGAGAG
TGTTCATTGCTGCACTGTGTCATTTGATCCCAGTTTTTTATTGAACACATATCCTTTAACACTCACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAAACACTAATTTCTGTGTTTTTTAGTAGGGTC
TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTTTTTTTGTTAAACTCATGTGTCTTTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATATATGTCTGTTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGT
CTGCTGTCTTCCTTCagttgtaatggaaagaaacactatgtgttgtagaggcaaaatttctgaaagtgataagggtttgcttactgaattctcattctccttgctttccagccacacgtgagcatctagctatctatacgct
GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCCCCCCCAACCCCTATAATGCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAAAC
ACCAATTGTTTTAAAAGTTTGTTTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGT
GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTGTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT
TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT التمهيدي الأمامي GAGAACCCACTGCTTAC التمهيدي العكسي TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTTTTGCCAAAATC

النتائج

الشكل 1: مثال على تسجيل فواصل زمنية لبويضة واحدة. تسجيلات Brightfield و YFP و mCherry لبويضة واحدة محقونة ب mRNAs التي تشفر Ypet / Interleukin-7 3 'UTR و mCherry متعدد الأدينيل في الطور الأول ، MI (6 ساعات بعد إطلاق cilostamide) ، و MII (بعد 15 ساعة من إطلاق cilostamide). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. GV = الحويصلة الجرثومية ؛ MI = الطور الأول ؛ MII = الطور ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إعداد وسائل الإعلام مسحوق الألبومين المصل البقري Bioxtra سيجما ألدريتش سيال-A3311 سيلوستاميد EMD ميليبور 231085 MEM ألفا جيبكو هاتف: 12561-056 الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي سيجما ألدريتش M2645 محلول البنسلين والستربتومايسين 100x ، مفلتر معقم شركة جينيسي العلمية (GenClone) 25-512 بيكربونات الصوديوم جي تي بيكر 3506-1 بيروفات الصوديوم جيبكو هاتف: 11360-070 ماء مقطر فائق النقاء إنفيتروجين 10977-015 تحضير mRNA لترميز YFP / 3 'UTR و mCherry أغاروز أبيكس بيوميديك 20-102 د.ق ملح كاربينيسيلين ثنائي الصوديوم سيجما ألدريتش C1389-1G طقم استنساخ Choo-Choo ماكلاب CCK-20 CutSmart Buffer (10x) نيو إنجلاند بيولابيس ب 7204 صبغة تحميل الحمض النووي (6x) الترمو: العلمية R0611 حل dNTP نيو إنجلاند بيولابيس N0447S DpnI نيو إنجلاند بيولابيس R0176 سلم الحمض النووي GeneRuler 1 كيلو بايت ثيرمو فيشر SM1333 ألواح LB Agar مع 100 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين ، Teknova تكنوفا L1010 رطل متوسط (كبسولات) MP الطب الحيوي 3002-021 طقم تنظيف النسخ MEGAclear تقنيات الحياة AM1908 إنزيم تقييد MfeI-HF نيو إنجلاند بيولابيس R3589 مجموعة النسخ mMESSAGE mMACHINE T7 إنفيتروجين AM1344 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة نيو إنجلاند بيولابيس M0530 طقم مخلفات بولي (أ) إنفيتروجين AM1350 QIAprep Spin Miniprep Kit كياجين هاتف: 27106 طقم استخراج جل QIAquick كياجين هاتف: 28704 S.O.C. متوسط ثيرمو فيشر 15544034 عازلة TAE أبيكس بيوميديك 20-193 محلول بروميد الإيثيديوم فائق النقاء تقنيات الحياة 15585011 مجموعة البويضات مجموعة أنبوب الشفاط للماصات الدقيقة المعايرة سيجما ألدريتش أ5177-5EA الماصات الدقيقة المعايرة شركة دروموند العلمية 2-000-025 PMSG- 5000 ماي بيوسورس MBS142665 إبرة PrecisionGlide 26 جم × 1/2 دينار بحريني 305111 حقنة 1 مل دينار بحريني 309659 الحقن الدقيق للبويضات طبق 35 مم | رقم 0 غطاء | قطر الزجاج 20 مم | غير مطلي ماتيك P35G-0-20-C للفحص المجهري بفاصل زمني زجاج البورسليكات مع خيوط أداة سوتر BF100-78-10 زيت لزراعة الأجنة إيرفين العلمية 9305 طبق بتري صقر 351006 للحقن الدقيق طبق زراعة الأنسجة صقر 353001 لحضانة البويضات VacuTip القابضة الشعيرات الدموية إيبندورف 5195000036 برمجيات بيوريندر بيو رندر إعداد الشكل 1 ق MetaMorph ، الإصدار 7.8.13.0 الأجهزة الجزيئية للفحص المجهري بفاصل زمني ، تحليل ترجمة UTR 3 بوصات