مقايسة مراقبة تحمض الأمعاء: تقنية لدراسة تحمض تجويف الأمعاء في ذبابة الفاكهة باستخدام صبغة بروموفينول الزرقاء

الملخص

المصدر: أبو، ف.، وآخرون. مراقبة تحمض الأمعاء في أمعاء ذبابة الفاكهة البالغة. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو فحصا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة الذبابة. بعد تناول الطعام المكمل بصبغة مؤشر الأس الهيدروجيني ، يؤدي تحمض تجويف الأمعاء إلى تغيير لون الصبغة. يوفر الفحص البصري للجهاز الهضمي للذباب لفحص تغير اللون دليلا على التحمض.

البروتوكول

ملاحظة: تم استخدام خط المختبر القياسي Oregon R كعنصر تحكم في WT. تم تربية جميع الذباب على وسط دقيق الذرة القياسي (يحتوي على دبس السكر ، والأجار ، والخميرة ، ودقيق الذرة ، والتيغوسيبت ، وحمض البروبيونيك ، والماء) في درجة حرارة الغرفة مع إيقاع الساعة البيولوجية الفاتح / الداكن لمدة 12/12 ساعة.

1. التحضير للفحص

1. اجمع إناث الذباب (0-2 أيام ، غير عذراء) تحت تخدير ثاني أكسيد الكربون₂ واسمح لها بالتعافي من طعام دقيق الذرة القياسي لمدة 3 أيام على الأقل قبل التجارب.
2. تجويع الذباب لمدة ~ 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) في قوارير تحتوي على منديل مناديل مختبر مبللة ب ~ 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
3. تحضير طعام الذباب بالبروموفينول الأزرق (BPB) على النحو التالي:
   1. قم بإذابة طعام الذباب في الميكروويف ثم اتركه يبرد حتى يصبح فاترا.
   2. أضف 1 مل من 4٪ BPB إلى 1 مل من الطعام الفاتر واخلطه جيدا.
   3. باستخدام ماصة ، أضف طعام الذباب الذي يحتوي على BPB في نقطة واحدة (~ 200 ميكرولتر) في وسط طبق بتري.

فئة

2. فحص مراقبة تحمض الأمعاء

1. انقل الذباب الجائع إلى طبق بتري يحتوي على نقاط مفردة (200 ميكرولتر) من طعام الذباب المكمل بنسبة 2٪ بروموفينول أزرق (BPB). اسمح للذباب بالبحث عن الطعام لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أثناء تعرضه للضوء.
2. بعد 4 ساعات ، اجمع الذباب وقم بتخديره على الجليد ؛ عزل أحشائه جراحيا.
   1. قم بإجراء الجراحة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) باستخدام ملقط تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد). اعزل القناة الهضمية عن طريق إمساك الصدر بزوج من الملقط وسحب البطن لأسفل بزوج ثان حتى يظهر CCR في القناة الهضمية ، مع الحرص على ضمان بقاء الأمعاء متصلة في كلا الطرفين.
3. حدد تحمض الأمعاء من خلال فحص لون CCR في الأمعاء (الشكل 1 ج ؛ يشير اللون الأصفر إلى التحمض ، والأزرق يشير إلى عدم تحمضه).
4. عد فقط تلك الذباب التي تظهر تلطيخا قويا في أحشائها.
5. احسب النسبة المئوية باستخدام المعادلة التالية:
   النسبة المئوية للذباب ذو الأحشاء المحمضة = عدد الذباب المحمض × 100 / (عدد الذباب المحمض + عدد الذباب غير المحمض)
   ملاحظه: تشير النسبة المئوية 0 إلى أنه لا يوجد ذباب يحمض أمعائه ، في حين أن نسبة 100 تشير إلى أن جميع الذباب قام بتحمض أمعائه.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مراقبة تحمض الأمعاء.(أ) الرسم التخطيطي لساحة التغذية. تمثل النقطة الزرقاء طعام الذباب باللون الأزرق البروموفينول (صبغة تشير إلى درجة الحموضة). تمثل البقع الأخرى ذباب الفاكهة. (ب) تمثيل رسومي للنسبة المئوية للذباب يظهر تحمض الأمعاء الذي يتم تغذيته لفترات مختلفة على مدى 4 ساعات. صور الأمعاء التمثيلية للأمعاء المحمضة والأمعاء غير المحمضة. يشير السهم ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بروموفينول الأزرق سيجما ألدريتش ب 0126 د. سيمولان ذبابة الفاكهة مركز مخزون الأنواع بجامعة كاليفورنيا ريفرسايد كاليفورنيا1 (https://www.drosophilaspecies.com/) د. انتصاب ذبابة الفاكهة مركز مخزون الأنواع بجامعة كاليفورنيا ديري سي 1 (https://www.drosophilaspecies.com/) د. pseudoobscura ذبابة الفاكهة مركز مخزون الأنواع بجامعة كاليفورنيا يوجين ، أوريغون (https://www.drosophilaspecies.com/) د. موهافينسيس ذبابة الفاكهة مركز مخزون الأنواع بجامعة كاليفورنيا جبال الشوكولاتة ، كاليفورنيا (https://www.drosophilaspecies.com/) ملقط علم الأحياء إينوكس كتالوج # 11252-20 مناديل كيم المبللة كيمتيك أوريغون ر مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) أطباق بتري فيشر ساينتيك كتالوج #FB0875713A محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) HyClone كتالوج # SH30258.01 مجهر مجسمة أوليمبوس SZ51 التكبير البصري