فحص امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا: طريقة قائمة على قارئ الألواح لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا المعزولة

Abstract

المصدر: Maxwell، J.T.، et al.، تحليلات تدفق الكالسيوم في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستنبتة. J. Vis. إكسب. (2018).

يصف هذا الفيديو فحصا قائما على قارئ اللوحة لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة. يحلل الاختبار إشارة التألق لصبغة فلورية حساسة للكالسيوم لدراسة حركية امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا والحمل الزائد للكالسيوم.

Protocol

1. الكواشف والحلول

1. اصنع 500 مل من المخزن المؤقت MS-EGTA لعزل الميتوكوندريا: 225 ملي مانيتول ، 75 ملي سكروز ، 5 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازي إيثان سلفونيك (HEPES) ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4 مع KOH. قم بتعقيمه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية. تأكد من تبريد المخزن المؤقت MS-EGTA مسبقا إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
2. تحضير 100 مل من KCl Buffer: 125 ملي KCl ، 20 ملي HEPES ، 1 ملي KH₂PO₄ ، 2 ملي ملي MgCl₂ ، 40 ميكرومتر EGTA ودرجة الحموضة المعدلة إلى 7.2 مع KOH. قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير 1 ملي مولار من مخزون الكالسيوم الأخضر -5N في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يمكن اقتباس مخزون الكالسيوم الأخضر -5N وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
4. تحضير ركائز لامتصاص Ca²⁺.
   1. تحضير 1 م بيروفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4. قم بتخزينه في حصص عند -20 درجة مئوية.
   2. تحضير 500 ملي مولار مالات ، درجة الحموضة 7.4. قم بتخزينه في حصص عند -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. عزل الميتوكوندريا القلبية

1. القتل الرحيم للفأر وفقا للمعايير المؤسسية.
   ملاحظه: بالنسبة لطريقتنا المعتمدة مؤسسيا للقتل الرحيم ، تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران والتضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم.
2. اجمع القلب عن طريق فتح تجويف الصدر ، وقطع جانبي الأضلاع ، وإحاطة القلب ، وقطع الحجاب الحاجز ، واستئصال أنسجة القلب><. ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم إجراء عزل الميتوكوندريا من قلب كامل تم جمعه من فأر بالغ (حوالي 120 مجم) ، والذي يجب أن يكون كافيا ل 3-4 تجارب. لعزل الميتوكوندريا عن الأنسجة الأخرى الغنية بالميتوكوندريا مثل الكبد ، يمكن استخدام ما يصل إلى 200 مجم من الأنسجة باتباع البروتوكول الموصوف.
3. اشطف الأنسجة جيدا في 25 مل من محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) المثلج للتأكد من إخراج كل الدم من البطين><ين. ملاحظه: سيتم شطف القلب بشكل كاف عندما يصبح السائل الذي يتم ضغطه من القلب صافيا.
4. افرم القلب إلى قطع صغيرة في 5 مل من 1x PBS المثلج باستخدام مقص حاد.
5. تخلص من PBS وانقل أنسجة القلب المفرومة إلى الخالط الزجاجي والتفلون Dounce المبرد مسبقا سعة 7 مل مع خلوص من 0.10 إلى 0.15 مم.
6. أضف 5 مل من المخزن المؤقت MS-EGTA المثلج ، وقم بتجانس العينة حتى تصبح قطع الأنسجة مرئية (حوالي 11 ضربة).
   ملاحظه: لا تفرط في تجانس الأنسجة لأن الهدف هو الحصول على الميتوكوندريا السليمة والوظيفية.
7. انقل المتجانس إلى أنبوب سعة 15 مل.
8. الطرد المركزي المتجانس عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق إلى نوى الحبيبات والخلايا غير المنقطعة.
9. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل وقم بطرده عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق إلى ميتوكوندريا الحبيبات.
10. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الميتوكوندريا على الجليد.
11. اغسل حبيبات الميتوكوندريا مرتين باستخدام عازلة MS-EGTA المثلجة. لكل غسلة ، قم بإعادة تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 5 مل من المخزن المؤقت MS-EGTA ، وقم بطردها عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
12. بعد الغسيل النهائي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الميتوكوندريا في 100 ميكرولتر من محلول MS-EGTA البارد. احتفظ بالميتوكوندريا على الجليد.
    ملاحظه: يجب استخدام الميتوكوندريا للتجريب في غضون 1 ساعة.
13. قم بقياس تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة بروتين برادفورد.

فئة

3. القياس القائم على قارئ الألواح لامتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا

ملاحظة: هنا ، يتم وصف بروتوكول تحليل امتصاص الميتوكوندريا Ca²⁺ باستخدام قارئ لوحة متعدد الأوضاع مزود بحقنات. يمكن استخدام أي قارئ لوحة لديه القدرة على قراءة مضان الكالسيوم الأخضر 5N (الإثارة / الانبعاث 506/532 نانومتر) في الوضع الحركي مع حاقنات الكاشف الآلي للحفاظ على التفاعل محميا من الضوء.

1. قم ببرمجة قارئ اللوحة لإجراء قراءة حركية لمضان الكالسيوم الأخضر 5N مع القياسات المأخوذة كل ثانية لوقت فحص إجمالي يبلغ 1,000 ثانية. بالإضافة إلى ذلك ، قم ببرمجة حاقنات الكاشف لتوزيع 5 ميكرولتر من محلول CaCl₂ عند 30 ثانية و 150 ثانية و 300 ثانية و 480 ثانية و 690 ثانية.
   ملاحظه: توقيت حقن CaCl₂ محدد من قبل المستخدم ، ويمكن تعديله وفقا للاحتياجات التجريبية.
2. قم بتجهيز حاقنات الكاشف بمحلول CaCl₂ المراد استخدامه.
   ملاحظه: يتم تحديد تركيز محلول CaCl₂ من قبل المستخدم ، ويمكن تعديله في عمليات التشغيل اللاحقة لمعايرة كمية Ca²⁺ المطلوبة لتشغيل فتح MPTP.
3. أضف 200 ميكروغرام من الميتوكوندريا إلى بئر فردي من صفيحة 96 بئرا.
4. أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت KCl إلى البئر بحيث يصل الحجم الإجمالي للميتوكوندريا والمخزن المؤقت KCl إلى 197 ميكرولتر.
5. أضف 1 ميكرولتر من 1 م بيروفات و 1 ميكرولتر من 500 ملي مولار مالات إلى خليط الميتوكوندريا. Pipet بلطف لخلط واحتضان الميتوكوندريا مع الركائز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للسماح للميتوكوندريا بالتنشيط.
6. أضف 1 ميكرولتر من 1 ملي من مخزون الكالسيوم الأخضر -5N. تخلط بلطف عن طريق سحب العينات.
   ملاحظه: حماية التفاعل من الضوء بعد إضافة صبغة الكالسيوم الأخضر 5N.
7. ابدأ البروتوكول الحركي المبرمج مسبقا وراقب مضان الكالسيوم الأخضر 5N.

Materials