مقايسة تسرب التألق لدراسة تفاعل الببتيد المخترق للخلايا مع الغشاء

الملخص

المصدر: Konate, K. et al. فحص تسرب الفلورسنت للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا. J. Vis. Exp. (2020)

يناقش هذا الفيديو مقايسة تسرب التألق لدراسة تفاعلات الببتيدات المخترقة للخلايا مع أغشية الخلايا باستخدام تقليد غشاء الخلية - حويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة ، أو LUVs ، مغلفة بصبغة فلورية ومروية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الحويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة (LUVs)

1. قم بإعداد LUVs لاستخدامها كمحاكاة لغشاء الخلية لمقايسة تسرب التألق.
2. تخلط مع حقنة زجاجية من هاميلتون فوسفاتيديل كولين (DOPC ، 786.11 جم / مول) ، سفينغوميلين (SM ، 760.22 جم / مول) والكوليسترول (كول ، 386.65 جم / مول) بنسبة المولية 4: 4: 2. يتم الحصول على محلول الدهون من محلول مخزون من كل دهون قابلة للذوبان في مذيب ميثانول / كلوروفورم (3/1 ؛ الحجم / الحجم) عند 25 مجم / مل في قارورة زجاجية مستديرة القاع سعة 25 مل. استنادا إلى 4 ميكرولتر من DOPC و 4 ميكرولتر من SM و 2 ميكرولتر من كول ، يتم الحصول على محلول الدهون من محلول المخزون عن طريق خلط 126 ميكرولتر و 117 ميكرولتر و 31 ميكرولتر على التوالي.
   أنذر: الميثانول مذيب سام وقابل للاشتعال والكلوروفورم سام ومسرطن. يجب التعامل مع كلاهما بالحماية المناسبة تحت غطاء المحرك.
3. تبخر الميثانول / الكلوروفورم باستخدام مبخر دوار تحت الفراغ خلال 45-60 دقيقة عند 60 درجة مئوية حتى تكوين طبقة دهنية جافة.
4. قم بإعداد اثنين من حلول التخزين المؤقت HEPES. قم بإعداد عازلة HEPES 1 عن طريق خلط 20 ملي مولار من HEPES (238.3 جم / مول) و 75 ملي كلوريد الصوديوم (58.44 جم / مول) واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإعداد المخزن المؤقت HEPES 2 عن طريق خلط 20 ملي مولار من HEPES و 145 ملي كلوريد الصوديوم واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. يمكن تخزين مخازن HEPES عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
   ملاحظه: يوصى بالتحقق من أسمولية المخازن المؤقتة باستخدام مقياس التناضح.
5. تحضير محلول ترطيب الدهون عن طريق إذابة زوجين مرويين صبغة الفلورسنت غير المنفذين للغشاء ، 8-أمينونافثالين -1 ، 3 ، 6-حمض تريسلفونيك ، ملح ثنائي الصوديوم عند 12.5 ملي مولار (النمل ، 427.33 جم / مول) و p-xylene-bispyridinium bromide عند 45 ملي مولار (DPX ، 422.16 جم / مول) في محلول عازلة HEPES. يؤدي خلط ANTS مع DPX إلى محلول أصفر. لتحقيق تركيزات 12.5 ملي مولار من ANTS و 45 ملي مولار من DPX ، قم بإذابة 21.4 مجم و 76 مجم ، على التوالي في 4 مل من محلول HEPES 1.
   ملاحظه: يمكن تخزين محلول ترطيب الدهون لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية عن طريق لف الأنبوب بورق الألمنيوم.
6. أعد تكوين الحويصلات متعددة الصفيحات (MLV) عن طريق تعليق الطبقة الدهنية المجففة ب 1 مل من محلول ترطيب الدهون وعن طريق الدوامة حتى تذوب طبقة الدهون المجففة. تأكد من إذابة المحلول تماما لأن مجاميع الدهون الصغيرة ستؤثر سلبا على الخطوات السابقة. تحقق أيضا من جدار القارورة الزجاجية ذات القاع المستدير للتأكد من عدم وجود طبقة دهنية متبقية.
   ملاحظه: سيظهر المحلول بلون لامع وأصفر فاتح بعد الذوبان.
7. قم بإخضاع الحويصلات لخمس دورات تجميد / ذوبان للحصول على حويصلات أحادية الصفيحة. قم بإجراء كل دورة عن طريق وضع القارورة الزجاجية ذات القاع المستدير لمدة 30 ثانية في النيتروجين السائل لخطوة التجميد ، ثم تركها في حمام مائي لمدة دقيقتين لخطوة الذوبان.
   ملاحظه: يجب أن تكون درجة حرارة ماء الاستحمام أعلى من 5-10 درجات مئوية من درجة حرارة انصهار الدهون.
8. قم بإعداد الطارد الدهني عن طريق إدخال اثنين من المرشحات المرطبة الأولية باستخدام عازلة HEPES في كل قطعة بثق بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) موضوعة في علبة الطارد المعدنية.
9. ضع غشاء بولي كربونات HEPES مرطب (حجم المسام 0.1 ميكرومتر ، قطر 25 مم) أعلى دعامة مرشح واحدة.
10. قم بتجميع علبتي الطارد المعدنيتين وقم بلفهما.
11. ضع الطارد المجمع في الحامل وأدخل حقنة سعة 1 مل في الفتحة المناسبة في أقصى كل قطعة من قطع بثق البولي تترافلورو إيثيلين. يتوافق البثق مع مرور السائل الذي تم اختباره من حقنة إلى أخرى عبر غشاء البولي كربونات.
12. اختبر الطارد باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت HEPES المحمل في إحدى المحاقن سعة 1 مل للتأكد من عدم وجود تسريبات أو مشاكل.
13. استبدل المخزن المؤقت HEPES سعة 1 مل بعينة MLV.
14. قم بإجراء البثق عن طريق تمرير عينة MLV من حقنة إلى أخرى عبر غشاء البولي كربونات 21 مرة على الأقل للحصول على LUVs موحدة من نفس الحجم.
    ملاحظه: يجب إجراء البثق عند درجة حرارة أعلى من درجة حرارة انصهار خليط الدهون.

< p class = "jove_title" >2. تنقية LUVs

1. قم بإعداد تنقية العمود لإزالة فائض النمل غير المغلف و DPX.
2. أدخل جل ديكستران متقاطع (G-50) معلق في وسط مائي مع 0.01٪ NaN₃ (65 جم / مول) في عمود كروماتوغرافيا سائل (Luer Lock ، غير مغلف ، 1.0 سم × 20 سم ، حجم السرير 16 مل) حتى 1 سم تحت الجزء العلوي من الجزء عديم اللون من العمود.
3. افتح الصنبور واترك السائل يتدفق لتسوية جل ديكستران المتشابك.
4. اغسل العمود عن طريق الشطب ب 20 مل من المخزن المؤقت HEPES 2 وتخلص من تدفق إخراج العمود.
5. أغلق الصنبور بمجرد تقليل الحجم الميت للمذيب فوق العمود (<100 ميكرولتر) ولكنه كاف لتجنب أي تجفيف لجل ديكستران المتشابك.
6. ضع LUVs المبثوقة حديثا (الصفراء) على العمود واتركها تدخل في جل ديكستران المتشابك.
7. أضف باستمرار المخزن المؤقت HEPES 2 إلى العمود لإجراء تنقية LUV.
8. قم بإزالة ما يقرب من 2 مل من عازلة HEPES 2 (لا تنس أن تملأ الجزء العلوي من العمود بانتظام لتجنب تجفيف جل الديكستران المتشابك): يهاجر محلول ANTS و DPX الأصفر الحر بشكل أبطأ من الجسيمات الشحمية.
9. ابدأ في جمع LUVs المنقاة في أنابيب (1.5 مل).
10. راقب قطرات الميعات من العمود وعندما تصبح بيضاءة ، فإنها تحتوي على الجسيمات الشحمية. قم بتغيير الأنبوب لاستعادة الكسر المحتوي على LUV.
11. قم بتخفيضه حتى تختفي القطرات (~ 1 مل). بعد ذلك ، قم بإزالة 0.5 مل أخرى في جزء منفصل ثم توقف عن الشطب.
    ملاحظة: تتوفر المعايير الآن في مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية، كمجموعات أو أوزان جزيئية فردية لمعايرة حجم شطف LUVs.
12. لف الأنابيب بألواح المضادة بورق الألمنيوم لتجنب تبييض صبغة التألق
.
13. اغسل العمود بمحلول HEPES 20 مل 2.
14. يمكن بعد ذلك تخزين LUVs لمدة أسبوع عند 4 درجات مئوية
    ملاحظة: نظرا لأن استقرار LUV قد يعتمد على تركيز LUV وتكوينه ، وكذلك على القوة الأيونية ، يجب التحكم في حجم LUVs باستخدام أداة تشتت الضوء الديناميكي (DLS) (انظر القسم 4. توصيف حجم LUV وتجانسه) قبل كل اختبار.

< p class = "jove_title" >3. تحديد تركيز LUVs

1. تقدير تركيز LUV بواسطة مجموعة قياس كمية الفوسفوليبيد, مما يتيح تقييم تركيز الكولين. يمكن تطبيق هذا الفحص عندما تكون الدهون الفوسفورية التي تحتوي على الكولين تحتوي على رأس قطبي كبيرة (>50٪ من LUVs).
2. قم بإعداد كاشف اللون عن طريق إذابة 18 مجم من ركيزة الكروموجين في 3 مل من المخزن المؤقت المقدم.
3. قم بتحميل كوفيت البوليسترين ، 10 × 10 × 45 مم ، مع 3 مل من كاشف اللون.
4. استخدم كاشف اللون النقي كشرط فارغ (فارغ). إضافة 20 ميكرولتر من عينة LUV (اختبار) أو 20 ميكرولتر من المحلول القياسي لتركيز الكولين المعروف (قياسي).
5. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية جميع الظروف (فارغة ، اختبار ، وقياسية).
6. قم بقياس الامتصاص (الكثافة البصرية ، OD) لعينة الاختبار والمحلول القياسي باستخدام المحلول الفارغ كعنصر تحكم عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
7. تحقق من قيم OD التي تمكن من تقدير تركيز الدهون من LUVs, C[LUV], في ما يعادل الكولين مقارنة بمعيار التركيز المعروف.
8. قم بإجراء الحساب باستخدام المعادلة التالية:
   C [LUV] (مول / لتر) = (عينة OD / معيار OD) × C [قياسي] (مول / لتر) < br / > ملاحظة: قدمت مجموعة القياس الكمي فوسفوليبيد كلوريد الكولين (139.6 ملغ/لتر) الحل القياسي في 54 ملغ/ديسيلتر المقابلة للتركيز المولي من C[قياسي] = 3.87 مليمول/لتر. عينة OD ومعيار OD هي الامتصاص تقاس في 600 نانومتر لحلول LUV والكولين, على التوالي.

< p class = "jove_title" >4. توصيف حجم LUV وتجانسه

1. قم بإجراء قياس باستخدام أداة DLS لتحديد حجم LUV (بالنانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PdI).
2. قم ببرمجة "إجراء التشغيل القياسي" (SOP) المخصص من خلال الإشارة إلى لزوجة المذيب / المخزن المؤقت والكوفيت المستخدم.
3. ضع 500 ميكرولتر من محلول LUV في كوفيت شبه دقيق من البوليسترين.
4. أدخل كوفيت البوليسترين شبه الدقيق في أداة DLS.
5. في درجة حرارة الغرفة ، قم بقياس توزيع الحجم من حيث متوسط الحجم (متوسط Z) لتوزيع الجسيمات والتجانس (مؤشر التشتت المتعدد ، PdI).
6. يتم الحصول على جميع النتائج من قياسين مستقلين يتم إجراؤهما في ثلاث دورات متكررة.
   ملاحظة: ستكون القيم القياسية للمركبات القياسية للمركبات القياسية متوسطة الحجم 137 ± 7 نانومتر مع PdI 0.149 ± 0.041.

< p class = "jove_title" >5. تحضير محاليل الببتيد

1. قم بإعداد محلول مخزون من الببتيد ، والذي يجب تحليله لمقايسة التسرب.
2. قم بإذابة مسحوق الببتيد (نقاء >95٪) في ماء نقي (على سبيل المثال ، 1 مجم ببتيد في 500 ميكرولتر من الماء النقي).
   ملاحظه: يوصى بتخفيف الببتيدات في الماء النقي وتجنب إذابة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، والتي يمكن أن تحفز القطع الأثرية (على سبيل المثال ، نفاذية الغشاء).
3. دوامة محلول الببتيد لمدة 5 ثوان.
4. قم بإجراء محلول الببتيد في حمام صوتنة مائي لمدة 5 دقائق ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 12،225 × جم. اجمع المادة الطافية لتحديد التركيز.
5. قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر لثلاثة تخفيفات ببتيد مستقلة ثم احسب تركيز الببتيد باستخدام معامل الانقراض المولي ε (اعتمادا على محتوى التربتوفان والتيروزين في تسلسل الببتيد) وقاعدة بير لامبرت.
   ملاحظه: إذا كان الببتيد يحتوي على التربتوفان والتيروزين ، يتم حساب معامل الانقراض المولي ε على أساس ε التربتوفان = 5،690 ^{م -1}سم ^-1 والتيروزين ε = 1،280 ^{م -1}سم ^-1. إذا كان تسلسل الببتيد لا يحتوي على التربتوفان أو التيروزين ، فيمكن إجراء مقايسة لونية أخرى لقياس التركيز (على سبيل المثال ، BCA أو برادفورد).
6. خفف محلول الببتيد في الماء النقي إلى محلول نهائي 100 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: في الماء النقي ، لا يحدث تدهور الببتيد أثناء التخزين 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، يجب قياس تركيز الببتيد كل أسبوعين للتأكد من عدم حدوث تبخر للماء.

فئة

6. فحص تسرب التألق

1. يتم قياس مقايسة تسرب التألق على مقياس الطيف الفلوري في درجة حرارة الغرفة. يتم تثبيت الطول الموجي للإثارة والانبعاث عند Ex = 360 نانومتر ± 3 نانومتر و Em = 530 نانومتر ± 5 نانومتر ، على التوالي.
2. تمييع LUVs في 1 مل عازلة HEPES 2 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر في كوفيت مضان كوارتز. أضف أداة تقليب مغناطيسية لتجانس المحلول أثناء التجربة.
3. قم بقياس LUVs وحدها خلال أول 100 ثانية ، بين t = 0 s و t = 99 ثانية من أجل الوصول إلى مضان الخلفية.
   ملاحظه: يمكن أيضا قياس LUVs وحدها خلال التجربة بأكملها (15 دقيقة) من أجل الوصول إلى مضان الخلفية والتسربات المحتملة.
4. بعد ذلك ، قم بقياس التسرب كزيادة في شدة التألق عند إضافة حصص من محلول الببتيد لمدة 900 ثانية (15 دقيقة). يتم تنفيذ هذا البروتوكول لكل تركيز من الببتيد تم اختباره من 0.1 ميكرومتر إلى 2.5 ميكرومتر.
5. أخيرا ، تم تحقيق مضان بنسبة 100٪ عن طريق إذابة LUVs عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من Triton X-100 (0.1٪ ، v / v) ، مما أدى إلى المسبار غير المروي تماما بين t = 1,000 ثانية و t = 1,100 ثانية.

< p class = "jove_title" >7. القياس الكمي للتسرب

1. قمع القيم التي تم الحصول عليها بعد t = 1,090 ثانية من أجل الاحتفاظ بنفس عدد النقاط لكل حالة مختبرة.
2. احسب الحد الأدنى من التألق ، F_min ، عن طريق جعل متوسط 50 نقطة بين t = 0 s و t = 49 s (LUVs وحدها).
3. احسب الحد الأقصى للتألق ، F_max ، عن طريق جعل متوسط 50 نقطة بين t = 1,041 ثانية و t = 1,090 ثانية (LUVs مع Triton X-100).
4. احسب نسبة التسرب (٪ التسرب) في كل نقطة زمنية (t = x) ، وفقا للمعادلة التالية:
   ٪ تسرب _{(t = x)} = (F _{(t = x)} - F_min) / (F_max - F_min) × 100
5. احسب المتوسط والانحراف المعياري للقيم التي تم الحصول عليها باستخدام مستحضر LUV مختلف (n ≥ 2) لنفس الحالة.
6. ارسم نسبة التسرب ، ٪ تسرب _{(t = x)} ، في دالة الوقت (الأزمنة).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 25 مل قارورة زجاجية مستديرة القاع بيركس 8-أمينونافثالين -1 ، 3 ، 6-حمض تريسلفونيك ، ملح ثنائي الصوديوم (ANTS) إنفيتروجين أ 350 الحماية من الضوء كلوروفورم سيجما ألدريتش 288306 كولسترول سيجما ألدريتش [ك8667] [ك] DOPC (ديولويل فوسفاتيديل كولين) أفانتي بولار 850375 ص حماية من الهواء الطارد أفانتي بولار 610000 مقياس الفلور بي تي آي سيرلابو حقنة زجاجية 50 ميكرولتر هاملتون 705 نيوتن هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 LabAssay فوسفوليبيد واكو 296-63801 عمود الكروماتوغرافيا السائلة سيجما ألدريتش ميثانول كارلو إربا 414902 غشاء البولي كربونات النوكليبور (حجم المسام 0.1 ميكرومتر ، قطر 25 مم) واتمان 800309 كوفيت البوليسترين ، 10 × 10 × 45 مم جرينر بيو ون 614101 كوفيت شبه ميكرو من البوليسترين ، DLS فيشر ساينتيك FB55924 بروميد p-xylene-bispyridinium (DPX) إنفيتروجين إكس 1525 الحماية من الضوء كوفيت كوارتز مضان هيلما 109.004واف-كيو إس نظام البخار الروتوبي هايدولف Z334898 راتنج Sephadex G-50 أميرشام 17-0042-01 أزيد الصوديوم (NaN3) سيجما ألدريتش S2002 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) سيجما ألدريتش S5886 USC300T حمام سونيكاتور VWR 142-6001 سفينغوميلين أفانتي بولار 860062 ف حماية من الهواء تريتون X-100 إيروميدكس 2000-ب زيتازيزر نانو زاس مالفيرن ZEN3500