فحص البروتين القابل للذوبان لتحديد محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة النباتية

الملخص

المصدر: Deans, C.A. et al. تحديد البروتين القابل للذوبان في النبات ومحتوى الكربوهيدرات القابل للهضم ، باستخدام الذرة (Zea mays) كمثال. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو طريقة لقياس الألوان لتحديد محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة النباتية. تستخدم الطريقة صبغة Coomassie Brilliant Blue G-250 ، والتي تتفاعل مع البروتين القابل للذوبان لتشكيل مركب صبغة بروتين مستقر باللون الأزرق ، يتناسب مع محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة.

البروتوكول

فئة

1. جمع النباتات ومعالجتها

1. جمع عينات المصنع ومعالجتها
   1. بعد جمع عينات النبات ، قم بتجميد العينات عن طريق غمس المواد النباتية في النيتروجين السائل باستخدام ملقط وتخزينها عند -80 درجة مئوية. إذا كانت عينات النبات التي تم جمعها كبيرة جدا بحيث لا يمكن تجميدها سريعا ، فقم بتبريد العينات بسرعة باستخدام الثلج الجاف ونقلها إلى فريزر -80 درجة مئوية في أسرع وقت ممكن. يمكن أن يتغير محتوى المغذيات الكبيرة للمواد النباتية بعد فصل الأنسجة عن النبات ، لذلك من المهم تجميد عينات النبات في أسرع وقت ممكن بعد جمعها.
      تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل قضمة الصقيع الشديدة عند ملامسته للجلد. يرجى التأكد من نقل النيتروجين السائل في حاويات معتمدة وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معه ، بما في ذلك القفازات المبردة ونظارات العين وواقي الوجه والمئزر ومعطف المختبر.
   قم
   2. بتجميد المواد النباتية باستخدام مجفف التجميد للتأكد من أن الأنسجة غير نشطة في التمثيل الغذائي أثناء إزالة الماء. جفف حتى تستقر كتلة العينة لضمان إزالة كل الماء.
   3. بمجرد أن تجف العينات ، قم بطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام مطحنة أو مطحنة. قم بتخزين العينات في خزانة تجفيف حتى التحليل.

< p class = "jove_title" >2. فحص البروتين القابل للذوبان

1. تحضير العينة
   1. قم بوزن العينات المكررة من كل نسيج ، حوالي 20 مجم لكل منها ، في 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من البوليسترين وأنابيب الملصقات. سيشار إلى هذه العينات لاحقا على أنها عينات غير معروفة. سجل الكتلة الدقيقة لكل عينة ، حيث ستكون هذه المعلومات مطلوبة لحساب النسبة المئوية للبروتين القابل للذوبان في كل عينة غير معروفة. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات أغطية القفل ، حيث قد تفتح الأغطية غير القابلة للقفل أثناء خطوة التسخين اللاحقة ، مما يؤدي إلى فقدان محلول العينة.
2. إذابة وعزل بروتينات العينة غير المعروفة
   1. باستخدام ماصة دقيقة، أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل أنبوب. أغلق الأغطية بإحكام وصوتنة لمدة 30 دقيقة. سخن حمام الماء الساخن 90 درجة مئوية
      تحذير: هيدروكسيد الصوديوم هو قاعدة قوية ويمكن أن يسبب حروقا عند ملامسته للجلد. على الرغم من أن 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم يمثل تركيزا منخفضا ، ارتد قفازات واقية لتجنب تهيج الجلد.
   2. ضع الأنابيب في رف في حمام الماء الساخن لمدة 15 دقيقة.
   3. أنابيب الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإخراج السائل الطافي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة تحمل علامة تجارية ، باستخدام طرف ماصة جديد لكل عينة. أضف 300 ميكرولتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 15,000 × جم لمدة 10 دقائق. مرة أخرى ، اجمع السائل الطافي وادمجه مع السائل الطافي الآخر من نفس العينة. هذه نقطة توقف محتملة ، ويمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل إذا لزم الأمر.
3. ترسيب البروتينات النباتية
   1. قم بتحييد الرقم الهيدروجيني للمحلول الطافي بإضافة 11 ميكرولتر من 5.8 M HCl. تأكد من الرقم الهيدروجيني ~ 7 عن طريق غمس ورق عباد الشمس في كل محلول عينة.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هو حمض قوي مسبب للتآكل يمكن أن يسبب حروقا عند ملامسته للجلد (تطبيق الجلد أو استنشاقه). يرجى ارتداء القفازات لمنع تهيج الجلد أثناء التعامل مع حمض الهيدروكلوريك
   2. أضف 90 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 100٪ (TCA) إلى كل أنبوب واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. سيؤدي ترسيب البروتينات إلى تحويل المحلول من صاف إلى معتم. إذا لم يحدث هذا بعد 30 دقيقة ، قم بتبريد الأنابيب لمدة 1 ساعة. هذه نقطة توقف محتملة ، ويمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل إذا لزم الأمر.
      تحذير: حمض ثلاثي كلورو أسيتيك مادة أكالة. يرجى ارتداء القفازات عند التعامل معها لمنع ملامسة الجلد وتجنب الاستنشاق.
   3. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية TCA بعناية عن طريق شفطها باستخدام خط تفريغ متصل بطرف ماصة زجاجية دقيقة دقيقة (يمكن استخدام نفس الطرف عبر العينات). لا تزعج حبيبات البروتين عن طريق تجنب الشفط الثقيل والحفاظ على مسافة مناسبة بين طرف الماصة والحبيبات.
   4. اغسل الحبيبات بسرعة ب 100 ميكرولتر من -20 درجة مئوية من الأسيتون. تزيل هذه الخطوة أي TCA متبقي من الحبيبات ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار برادفورد اللاحق ؛ ومع ذلك ، سيبدأ الأسيتون في إذابة حبيبات البروتين إذا تركت على اتصال طويل جدا ، لذلك يجب إضافة الأسيتون ثم استخراجه بسرعة من الحبيبات في غضون 5 ثوان.
   5. اسمح للأسيتون بالتبخر عن طريق وضع الأنابيب في شفاط الدخان أو الثلاجة. ثم, قم بإذابة حبيبات البروتين بإضافة 1 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل أنبوب. قد يتطلب إذابة الحبيبات بالكامل عدة جولات من التسخين في حمام الماء الساخن, دوامة, والصوتنة.
      ملاحظة: كلما طالت مدة بقاء الأنابيب في غطاء الدخان أو الثلاجة وكلما أصبحت الكريات أكثر جفافا ، زادت صعوبة إعادة إذابتها. يقترح تجفيف الحبيبات لمدة 30 دقيقة ، ثم التحقق من وجود الأسيتون كل 10-15 دقيقة حتى يتضح أن الأسيتون قد تبخر (لا يمكن اكتشاف أبخرة الأسيتون).
4. امزج المحاليل القياسية ، وقم بتخفيف محاليل العينات غير المعروفة ، وحدد محتوى البروتين الكلي للعينات غير المعروفة باستخدام مقايسة برادفورد.
   1. تحضير المحاليل القياسية للغلوبولين المناعي البقري G (IgG) وفقا للتركيزات المدرجة في الجدول 1 (يمكن خلط محلول مخزون IgG المجفف بالتجميد أو IgG بالماء منزوع الأيونات لتحقيق كل تركيز). معايير التخزين في 4 درجات مئوية. في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، أضف 160 ميكرولتر من كل محلول قياسي IgG في ثلاث نسخ بدءا من موضع A1 للوحة البئر (0 ميكروغرام / ميكرولتر في موضع A1 ، A2 ، A3 ، 0.0125 ميكروغرام / ميكرولتر في مواضع B1 ، B2 ، B3 ، إلخ).
   2. قم بإعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم المخفف بإضافة 50 ميكرولتر من 0.1 مولار من هيدروكسيد الصوديوم إلى 950 ميكرولتر من الماء المقطر. كعنصر تحكم سلبي فارغ ، أضف 60 ميكرولتر من هذا المحلول إلى لوحة البئر في ثلاث نسخ (مواضع G1 ، G2 ، G3).
   3. قم بإعداد تخفيفات لعينات غير معروفة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من كل محلول عينة إلى 950 ميكرولتر من الماء المقطر في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. ثم أضف 60 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى صفيحة البئر ثلاث نسخ ، بدءا من موضع H1. يجب أن تسمح اللوحة المكونة من 96 بئرا بتحليل 6 معايير ، و 1 فارغة ، و 25 عينة غير معروفة عند قراءتها بثلاث نسخ. يجب أن تحتوي كل لوحة بئر تم تحليلها على عينات IgG القياسية والفارغة الخاصة بها.
   4. أضف 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى جميع آبار العينات الفارغة وغير المعروفة. الآن يجب أن يحتوي كل بئر على إجمالي 160 ميكرولتر. باستخدام ماصة متعددة القنوات (8 قنوات) ، أضف 40 ميكرولتر من صبغة البروتين G-250 الزرقاء اللامعة Coomassie إلى كل بئر في العمود الأول من لوحة البئر. امزج الصبغة مع العينات عن طريق الغرق عدة مرات. كرر ذلك مع جميع الأعمدة الأخرى، مع استبدال أطراف الماصة لتجنب التلوث.
      تحذير: Coomassie الأزرق اللامع G-250 مهيج ويجب تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الرئتين. يرجى ارتداء القفازات لمنع ملامسة الجلد. في حالة حدوث ملامسة للجلد ، سوف يلطخ هذا المنتج.
   5. استخدم إبرة لتفجير أي فقاعات موجودة في الآبار ، لأنها قد تتداخل مع قراءة مقياس الطيف الضوئي الدقيق. نظف الإبرة لتجنب التلوث بين الآبار. دع الصفيحة الدقيقة تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   6. باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري ، سجل قيم الامتصاص لكل بئر عند 595 نانومتر.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. حسابات المنحنى القياسية لمقايسة البروتين القابل للذوبان.يتم حساب كمية البروتين في كل معيار عن طريق أخذ تركيز كل معيار وضربه في كمية المحلول القياسي في كل بئر (160 ميكرولتر).

تركيز IgG (ميكروغرام / ميكرولتر) البروتين في العينات القياسية (ميكروغرام) 0.0000 0 0.0125 2 0.0250 4 0.0375 6 0.0500 8 0.1000 16

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قارئ الألواح الدقيقة (مقياس الطيف الضوئي) بيو راد الموديل 680 XR مركز كاشف صبغة فحص البروتين Bio-Rad بيو راد #5000006 450 مل