الفحص اللوني للقياس الكمي للكربوهيدرات غير الهيكلية في الأنسجة النباتية

الملخص

المصدر: Deans, C.A.et al. تحديد البروتين القابل للذوبان في النبات ومحتوى الكربوهيدرات القابل للهضم ، باستخدام الذرة (Zea mays) كمثال. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو طريقة تحديد كمية الكربوهيدرات القابلة للهضم الموجودة في الأنسجة النباتية. يساعد هذا في جمع البيانات من الأنسجة النباتية المختلفة لدراسة البيئة الغذائية والتفاعلات بين النباتات العاشبة وديناميكيات شبكة الغذاء.

البروتوكول

فئة

1. جمع النباتات ومعالجتها

1. بعد جمع عينات النبات ، قم بتجميد العينات عن طريق غمس المواد النباتية في النيتروجين السائل باستخدام ملقط وتخزينها عند -80 درجة مئوية. إذا كانت عينات النبات التي تم جمعها كبيرة جدا بحيث لا يمكن تجميدها سريعا ، فقم بتبريد العينات بسرعة باستخدام الثلج الجاف ونقلها إلى فريزر -80 درجة مئوية في أسرع وقت ممكن. يمكن أن يتغير محتوى المغذيات الكبيرة للمواد النباتية بعد فصل الأنسجة عن النبات ، لذلك من المهم تجميد عينات النبات في أسرع وقت ممكن بعد جمعها.
   أنذر: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل قضمة الصقيع الشديدة عند ملامسته للجلد. يرجى التأكد من نقل النيتروجين السائل في حاويات معتمدة وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معه ، بما في ذلك القفازات المبردة ونظارات العين وواقي الوجه والمئزر ومعطف المختبر.
قم
2. بتجميد المواد النباتية باستخدام مجفف التجميد للتأكد من أن الأنسجة غير نشطة في التمثيل الغذائي أثناء إزالة الماء. جفف حتى تستقر كتلة العينة لضمان إزالة كل الماء.
3. بمجرد أن تجف العينات ، قم بطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام مطحنة أو مطحنة. قم بتخزين العينات في خزانة تجفيف حتى التحليل.

< p class = "jove_title" >2. فحص الكربوهيدرات القابلة للهضم

1. تحضير العينة
   1. قم بوزن العينات المكررة من كل نسيج، حوالي 20 مجم لكل منها، في أنابيب زجاجية سعة 15 مل بأغطية لولبية مبطنة بالمطاط (طول 100 مم). سيشار إلى هذه العينات لاحقا على أنها عينات غير معروفة. قم بتسمية الأنابيب بعلامة مقاومة للماء أو بشريط لاصق على الأغطية وسجل الكتلة الدقيقة لكل عينة ، حيث ستكون هذه المعلومات مطلوبة لحساب النسبة المئوية للكربوهيدرات في كل عينة غير معروفة.
2. استخرج الكربوهيدرات القابلة للهضم من كل عينة غير معروفة.
   1. أضف 1 مل من 0.1 م H₂SO₄ إلى كل أنبوب وقم بربط أغطية المسمار على الأنابيب بإحكام. ضعها في حمام مائي مغلي لمدة 1 ساعة.
      أنذر: حمض الكبريتيك شديد التآكل. يرجى ارتداء القفازات ونظارات العين والمئزر عند التعامل مع H₂SO₄ ، وتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان.
   2. قم بتبريد الأنابيب في حمام مائي فاتر. صب محتويات الأنبوب في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل (لا تقلق إذا بقيت بعض المواد النباتية في الأنابيب الزجاجية).
   3. أنابيب الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السائل الطافي باستخدام ماصة دقيقة وضعه في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة تحمل علامة 1.5 مل. يمكن تبريد الأنابيب طوال الليل في هذه المرحلة. إذا استمرت في الفحص ، فراجع الخطوة 2.3.2.
3. امزج المحاليل القياسية وحدد إجمالي محتوى الكربوهيدرات القابل للهضم للعينات غير المعروفة.
   1. قم بإعداد محاليل الجلوكوز القياسية D (+) بالتركيزات المدرجة في الجدول 1. قم بإعداد ستة أنابيب اختبار زجاجية بسعة 400 ميكرولتر من كل محلول قياسي.
   2. الماصة 15 ميكرولتر من كل عينة غير معروفة في أنبوب الاختبار الخاص بها وإضافة 385 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل منها لحجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر في كل أنبوب اختبار. في غطاء الدخان ، أضف 400 ميكرولتر من 5٪ فينول إلى كل أنبوب اختبار عينة قياسي وغير معروف ، ثم قم بإدخال ماصة 2 مل من H₂SO₄ المركز بسرعة في كل أنبوب. لا تلمس محتويات أنبوب الاختبار بطرف الماصة، فقط أضفها إلى سطح المحلول (تعمل الماصة المكررة بشكل أفضل لهذا الغرض).
   3. دع الأنابيب تحتضن لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتدوير الأنابيب بعناية لخلط المحتويات. احتضن لمدة 30 دقيقة إضافية.
      أنذر: الفينول وحمض الكبريتيك مهيجات مسببة للتآكل. للحماية من التعرض للجلد والعينين والاستنشاق ، يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان الكيميائي باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والتي تشمل: واقي الوجه أو نظارات العين ، والقفازات المطاطية ، ومئزر المختبر ، والأحذية. يؤدي خلط الفينول مع حمض الكبريتيك أيضا إلى تفاعل طارد للحرارة ، مما يؤدي إلى تسخين الأنابيب.
   4. الماصة 800 ميكرولتر من العينة من كل أنبوب في كل من 3 كوفيت شبه دقيقة من البوليسترين سعة 1.5 مل (3 مكررات تقنية لكل عينة). اضبط مقياس الطيف الضوئي على القراءة عند 490 نانومتر. قم بالمعايرة على كوفيت فارغ يحتوي على ماء مقطر قبل قراءة المعايير أو العينات غير المعروفة ، وبشكل متقطع طوال قراءات العينات. قم بتشغيل كل كوفيت من خلال مقياس الطيف الضوئي وسجل الامتصاص. المتوسط عبر التكرارات التقنية لكل عينة غير معروفة.
      ملاحظه: في بعض الحالات ، قد تتجاوز العينات عتبة الامتصاص العليا. إذا كان الأمر كذلك ، فيجب تخفيف العينات في الخطوة 1.3.1. يجب أيضا حساب التخفيفات في الحسابات اللاحقة.
   5. احسب متوسط الامتصاص لكل معيار.
      ملاحظه: لحساب كمية الكربوهيدرات الكلية القابلة للهضم الموجودة في كل عينة غير معروفة باستخدام المنحنى القياسي ، من الأسهل تراجع متوسط امتصاص كل معيار مقابل ميكروغرام من الجلوكوز D (+) الموجود في كل معيار ، ولكن يمكن للمرء أيضا رسم تركيز الجلوكوز D (+) (ميكروغرام / ميكرولتر) لكل معيار إذا كان ذلك مرغوبا فيه. ومع ذلك ، تشير الحسابات التالية إلى منحنى قياسي يعتمد على ميكروغرام ، وليس التركيزات (ميكروغرام / ميكرولتر).
   6. احسب المنحنى القياسي عن طريق رسم متوسط الامتصاص مقابل الكمية الإجمالية للجلوكوز D (+) (ميكروغرام) في كل محلول قياسي. قم بتركيب خط انحدار خطي لهذه البيانات ، ثم استخدم المعادلة التالية لحساب الكمية الإجمالية للكربوهيدرات (ميكروغرام) في كل عينة غير معروفة:
      م_ج = (((أ_× - ب) / م) / (15)) * 1000 < / > M_c = ميكروغرام من الكربوهيدرات في العينة
      A_x = متوسط امتصاص عينة غير معروفة
      b = تقاطع y (خط الانحدار القياسي)
      م = المنحدر (خط الانحدار القياسي)
      يجب أن يكون معامل الارتباط لهذا الخط أكبر من 0.98 وقريبا بشكل روتيني من 0.99. بعد ذلك ، استخدم المعادلة التالية لتحديد النسبة المئوية للكربوهيدرات في كل عينة:
      P_c = ((M_c / 1000) / (M_i)) * 100
      P_c =٪ الكربوهيدرات
      M_i = الكتلة الابتدائية للعينة (مجم)

< p class = "jove_content" > الجدول 1. حساب المنحنى القياسي لمقايسة الكربوهيدرات القابلة للهضم. يتم حساب كمية الجلوكوز في كل معيار عن طريق أخذ تركيز كل معيار وضربه في كمية المحلول القياسي في كل أنبوب اختبار (400 ميكرولتر)

تركيز الجلوكوز D (+) (ug / uL) د (+) الجلوكوز في العينات القياسية (ug) 0.0000 0 0.0375 15 0.0750 30 0.1125 45 0.1500 60 0.1875 دولار 75

المواد