مقايسة النمو القائمة على لوسيفيراز لتحديد تكاثر الطفيليات داخل الخلايا

الملخص

المصدر: Key ، M. ، et al. ، تحديد كفاءة المثبط الكيميائي ضد نمو التوكسوبلازما جوندي داخل الخلايا باستخدام مقايسة النمو القائمة على لوسيفيراز. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح اختبار لوسيفيراز لتحديد نمو العامل الممرض داخل الخلايا Toxoplasma gondii. باستخدام سلالة من التوكسوبلازما التي تعبر عن إنزيم لوسيفيراز بعد إصابة الخلايا المضيفة ، يتم الكشف عن نشاط لوسيفيراز في ثقافة الخلايا المصابة لتحديد التكاثر الناجح للطفيلي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. مقايسة نمو التوكسوبلازما القائمة على لوسيفيراز

1. بذور الخلايا الليفية للقلفة البشرية (HFFs) قبل أسبوع واحد من تلقيح الطفيليات للتأكد من أن الخلايا المضيفة ملتقى تماما. قم بإجراء فحص وهمي في لوحة شفافة للتأكد من بقاء الطفيليات داخل الخلايا طوال فترة التقييم.
   ملاحظه: هنا ، يتم إجراء الفحص في 96 بئر من الصفائح الدقيقة. وفقا للاحتياجات التجريبية ، يمكن توسيع نطاقها حتى 384 أو 1536 بئر صفيحة دقيقة.
2. مرر طفيليات التوكسوبلازما إلى HFFs ملتقى قبل يومين من الاستخدام عن طريق نقل ~ 0.3-0.4 مل من الطفيليات المحللة بالكامل إلى قارورة T25. احتضان الخلايا المضيفة المصابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين.
3. حقنة 5 مل من الطفيليات الطازجة من خلال إبرة أمان 21 جم 5x لتحرير الطفيليات داخل الخلايا ، ثم تمر عبر مرشح 3 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية المضيفة. اشطف الطفيليات المتبقية من القارورة باستخدام 7 مل من وسط D10 الخالي من الفينول الأحمر ، ثم مرره عبر الفلتر مرة أخرى.
4. طفيليات الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط D10 الخالية من الفينول باللون الأحمر.
5. عد الطفيليات باستخدام مقياس كثافة الدم لتحديد التركيز.
6. تمييع الطفيليات إلى 1 × 10⁴ طفيليات/مل للسلالة البرية (WT). بالنسبة لسلالات الطفيليات التي تعاني من نقص النمو ، قم بزيادة التركيز وفقا لذلك لملاحظة زيادة كبيرة في إشارات لوسيفيراز.
7. قم بشفط الوسائط بعناية من 96 صفيحة دقيقة بئر مزرعة مسبقا باستخدام HFFs وتلقيح 150 ميكرولتر من إعادة تعليق الطفيليات في الآبار في شكل ثلاثة أعمدة وخمسة صفوف ، وهو ما يمثل ثلاث تكرارات تقنية وخمس نقاط زمنية.
8. احتضان الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات.
9. قم بشفط الوسائط بعناية من الآبار لإزالة الطفيليات غير المغزوة ، ثم املأ الآبار بوسائط RT الفينول الخالية من اللون الأحمر في كل صف (باستثناء الصف الأول).
10. امزج كميات متساوية من PBS و 2x luciferase assay buffer وخفف ركيزة luciferase إلى 12.5 ميكرومتر.
11. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز المخففة في كل بئر من الصف العلوي. احتضان الصفائح الدقيقة في RT لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالتحليل بالكامل.
12. قم بقياس نشاط لوسيفيراز باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. يتم سرد إعدادات قارئ اللوحة في الجدول 1. تمثل كل قراءة العدد الأولي للطفيليات التي تم غزوها بعد 4 ساعات من الإصابة.
13. كرر الخطوات 1.9-1.12 لكل صف كل 24 ساعة لمدة 4 أيام دون تغيير الوسيط. تعكس هذه القراءات العدد الإجمالي للطفيليات المكررة بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة.
14. احسب متوسط القراءات في كل نقطة زمنية وقسمه على متوسط القراءات في 4 ساعات لتحديد تغيرات الطية في نمو الطفيليات بمرور الوقت.
15. ارسم البيانات باستخدام برنامج الرسوم البيانية.
16. لحساب وقت المضاعفة، ارسم قيم log2 لتغييرات الطي في النقاط الزمنية الفردية خلال وقت الحضانة. استخدم دالة الانحدار الخطي لحساب المنحدر ، والذي يمثل وقت مضاعفة كل سلالة.

الجدول 1: إعدادات قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس نشاط اللوسيفيراز أثناء مقايسة نمو التوكسوبلازما القائمة على اللوسيفيراز

لوسيفيراز: نقطه النهايه وقت التكامل: 1 ثانية مجموعة المرشحات - الانبعاث: إضاءة كاملة البصريات: أعلى كسب: 135 ريال سرعة القراءة: عادي تأخر: 100 مللي ثانية قراءة الارتفاع: 4.5 ملم

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Biotek Synergy H1 قارئ صفيحة دقيقة هجين متعدد الأوضاع BioTek Instuments كولينترازين ح Prolume 301-10 هيچ كيتز برمجيات برنامج GraphPad Prism (الإصدار الثامن)