اختبار لوسيفيراز لدراسة فعالية المواد الكيميائية المضادة للطفيليات ضد الطفيليات

الملخص

المصدر: Key, M., et al. تحديد كفاءة المثبط الكيميائي ضد نمو التوكسوبلازما غوندي داخل الخلايا باستخدام مقايسة النمو القائمة على لوسيفيراز. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح الفيديو مقايسة لوسيفيراز المستخدمة لتحديد فعالية مثبط كيميائي مضاد للطفيليات ضد العامل الممرض داخل الخلايا Toxoplasma gondii. تتضمن الدراسة طفيليات تعبر عن لوسيفيراز تغزو الخلايا المضيفة للتكاثر والبقاء على قيد الحياة. يرتبط المثبط الكيميائي ببروتياز السيستين للطفيلي ويمنع التكاثر. يتناسب نشاط اللوسيفيراز المكتشف مع تغيرات الطية في نمو الطفيليات ، مما يحدد فعالية الدواء ضد الطفيلي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تقييم فعالية تثبيط المركب الكيميائي ضد نمو التوكسوبلازما

ملاحظة: هنا ، يتم تقديم تقييم تثبيط LHVS في نمو التوكسوبلازما كمثال. تم اختبار ثمانية تركيزات مختلفة من LHVS ، ويتم إجراء ثلاثة تكرارات تقنية لكل من التكرارات البيولوجية الثلاثة لكل من سلالات RHΔku80 :: NLuc و RHΔku80Δcpl :: NLuc.

1. قبل الإصابة بالطفيليات ، كانت بذور HFFs إلى 96 بئرا من الصفائح الدقيقة في شكل ثلاثة صفوف وتسعة أعمدة لتكرار بيولوجي واحد لكل مركب لكل سلالة. سيسمح للخلايا المضيفة بالنمو لمدة 7 أيام على الأقل قبل الاستخدام.
2. تمرير طفيليات RHΔku80 :: NLuc و RHΔku80Δcpl :: NLuc لمدة يومين قبل الاستخدام.
3. مرر طفيليات التوكسوبلازما إلى HFFs ملتقى قبل يومين من الاستخدام عن طريق نقل ~ 0.3-0.4 مل من الطفيليات المحللة بالكامل إلى قارورة T25. احتضان الخلايا المضيفة المصابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين.
4. حقنة 5 مل من الطفيليات الطازجة من خلال إبرة أمان 21 جم 5x لتحرير الطفيليات داخل الخلايا ، ثم تمر عبر مرشح 3 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية المضيفة. اشطف الطفيليات المتبقية من القارورة باستخدام 7 مل من وسط D10 الخالي من الفينول الأحمر ، ثم مرره عبر الفلتر مرة أخرى.
5. طفيليات الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط D10 الخالية من الفينول باللون الأحمر.
6. عد الطفيليات باستخدام مقياس كثافة الدم لتحديد التركيز.
7. تمييع الطفيليات إلى 1 × 10⁴ طفيليات/مل للسلالة البرية (WT). بالنسبة لسلالات الطفيليات التي تعاني من نقص النمو ، قم بزيادة التركيز وفقا لذلك لملاحظة زيادة كبيرة في إشارات لوسيفيراز.
8. أعد تعليق الطفيليات في وسائط خالية من الفينول الأحمر عند 1 × 10⁴ طفيليات / مل.
9. استنشق الوسائط من صفيحة تحتوي على HFFs ملتقى وتلقيح كل بئر ب 150 ميكرولتر من إعادة تعليق الطفيليات. احتضان الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات.
10. تحضير LHVS بثمانية تركيزات مختلفة في خزان مكون من 12 بئرا عن طريق التخفيف التسلسلي. بشكل عام ، يتم تقليل التركيزات بمقدار ثلاثة أضعاف بطريقة التخفيف التسلسلي.
    ملاحظه: يتم تقليل أدنى تركيز بمقدار 6,561 ضعفا مقارنة بأعلى تركيز. يمكن تعديل تغيير الطية في التخفيف وفقا لذلك بناء على الخصائص المختلفة للمركبات الفردية.
11. بعد 4 ساعات من الإصابة ، قم بشفط الوسائط لإزالة الطفيليات غير الغازية وملء كل بئر من الأعمدة 2-9 ب 150 ميكرولتر من الوسائط المكملة ب LHVS بتركيزات مختلفة. اترك العمود الأول مملوءا بالوسط العادي ليكون بمثابة عنصر تحكم غير معالج.
12. احتضان الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 96 ساعة إضافية.
13. قم بشفط الوسائط بعناية من الآبار لإزالة الطفيليات غير المغزوة ، ثم املأ الآبار بوسائط RT الفينول الخالية من اللون الأحمر في كل صف (باستثناء الصف الأول).
14. امزج كميات متساوية من PBS و 2x luciferase assay buffer وخفف ركيزة luciferase إلى 12.5 ميكرومتر.
15. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز المخففة في كل بئر من الصف العلوي. احتضان الصفائح الدقيقة في RT لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالتحليل بالكامل.
16. قياس نشاط لوسيفيراز الآبار الفردية.
17. متوسط أنشطة لوسيفيراز لثلاثة مكررات تقنية من آبار كل تركيز فردي من LHVS.
18. اقسم متوسط نشاط اللوسيفيراز لكل تركيز LHVS على متوسط نشاط اللوسيفيراز المشتق من الطفيليات غير المعالجة لحساب نشاط اللوسيفيراز الطبيعي كنسبة مئوية.
19. ارسم أنشطة لوسيفيراز الطبيعية مقابل تركيزات LHVS الفردية باستخدام برنامج الرسوم البيانية (الشكل 1). يتم أيضا قياس تثبيط البيريميثامين ضد نمو الطفيليات كعنصر تحكم. بيريميثامين هو مضاد حيوي سريري يستخدم لعلاج داء المقوسات الحاد عن طريق تثبيط استقلاب حمض الفوليك في المقوسات.
20. احسب قيم IC₅₀ للمركبات الفردية باستخدام الطريقة المضمنة في برنامج الرسوم البيانية ، والاستجابة الطبيعية مقابل [المثبط] ، في إطار برنامج الانحدار "تثبيط الجرعة-الاستجابة". يتم حساب IC₅₀ باستخدام الصيغة التالية:
    Y = 100 / (1 + X / IC₅₀)
    حيث: يمثل Y أنشطة لوسيفيراز طبيعية للخلايا المصابة تحت تركيزات مختلفة من المثبطات ، ويمثل X تركيزات فردية من المثبط.

النتائج

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تقييم فعالية تثبيط LHVS والبيريميثامين باستخدام مقايسة النمو القائمة على لوسيفيراز. تم تلقيح الطفيليات في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا لمدة 4 ساعات للسماح بغزو الخلايا المضيفة. تم غسل الطفيليات غير المغزوة ، وتم ملء الصفيحة بوسائط تحتوي على تركيزات مختلفة من LHVS أو البيريميثامين وتم تحضينها لمدة 96 ساعة إضافية قبل تحديد نشاط لوسيفيراز. تم تطبيع قراءات اللوسيفيراز المق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Biotek Synergy H1 قارئ صفيحة دقيقة هجين متعدد الأوضاع BioTek Instuments كولينترازين ح Prolume 301-10 هيچ كيتز برمجيات برنامج GraphPad Prism (الإصدار الثامن)