مقايسة استخراج Msp1 لدراسة إزالة بروتينات TA غير الموضعية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Fresenius ، H. L. ، Wohlever ، M. L. إعادة تكوين نشاط استخراج Msp1 بمكونات منقاة بالكامل. J. Vis. إكسب. (2021).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا في المختبر لدراسة الإزالة بوساطة Msp1 لبروتينات TA غير الموضعية المدمجة في الطبقة الدهنية الثنائية للجسيمات الشحمية. يتم إعادة تكوين بروتينات Msp1 و TA بشكل مشترك في الجسيمات الشحمية ، ويتم تأكيد الانتقال المعتمد على ATP لبروتينات TA من خلال تنقية التقارب.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. تحضير الجسيمات الشحمية

1. اجمع بين مخزون الكلوروفورم من الدهون بنسب مناسبة لتقليد غشاء الميتوكوندريا الخارجي.
   1. تحضير 25 مجم من خليط الدهون. نحن نستخدم مزيجا تم إنشاؤه مسبقا من الدهون التي تحاكي أغشية الميتوكوندريا ، والتي تتكون من نسبة مولارية 48: 28: 10: 10: 4 من فوسفاتيديل كولين بيض الدجاج (PC) ، فوسفاتيديل إيثانول بيض الدجاج (PE) ، فوسفاتيديل إينوزيتول في كبد البقر (PI) ، الاصطناعية 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) ، والاصطناعية 1 '، 3'-مكرر [1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (TOCL). يتم عرض عينة من الحسابات في الجدول 1.
   2. أحضر جميع مخزونات الدهون إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح لأن ذلك سيحد من التكثيف. نظرا لأن معظم المختبرات ليس لديها طريقة دقيقة لقياس تركيز الدهون ، فإن أي ماء يمتصه مخزون الكلوروفورم سيغير تركيز مخزون الدهون وبالتالي نسبة الدهون المستخدمة في الفحص.
   3. نظرا لأن مخزون الدهون يأتي في أمبولات زجاجية ، انقل الكمية المطلوبة من الدهون إلى قارورة زجاجية باستخدام حقنة سعة 1 مل. أضف 2 مجم من الديثيوثريتول (DTT) إلى القارورة لمنع أكسدة الدهون. اعمل بسرعة لأن تبخر الكلوروفورم سيغير تركيز الدهون.
   4. انقل أي دهون متبقية إلى قارورة زجاجية منفصلة وقم بتثبيتها مع حاجز PFTE. أضف 2 مجم من DTT إلى القارورة ، ولفها بالبارافيلم ، واحفظها في -20 درجة مئوية لمنع أكسدة الدهون. حاول استخدام الدهون في غضون 3 أشهر من نقلها إلى القوارير. لمنع التلوث المحتمل لمخزونات الكلوروفورم عن طريق جريان العلامات، انقل الملصقات من الأمبولات الأصلية إلى القوارير الزجاجية بدلا من الملصقات بعلامة.
2. تبخر الكلوروفورم تحت تيار لطيف جدا من النيتروجين أثناء تدوير القارورة الزجاجية بشكل مستمر يدويا في غطاء الدخان ، ويعمل بشكل أساسي كحلقة دخانية يدوية. قم بتدوير القارورة بسرعة ثابتة (20-40 دورة في الدقيقة) يدويا للحفاظ على حركة الدهون. الهدف هو تبخير كل الكلوروفورم والحصول على طبقة متساوية من الدهون على القارورة الزجاجية بأكملها.
   أنذر: الكلوروفورم سام للأعصاب ، ويجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان.
   1. قم بتوصيل ماصة باستور جديدة بأنبوب النيتروجين. لا تدع أيا من الدهون تتناثر من القارورة أو على ماصة باستور. صوب الطرف في الجزء السفلي من القارورة حتى يرتد الهواء عن القاع ويدفع الدهون لأعلى نحو مركز القارورة. احصل على طلاء متساو على القارورة بأكملها مع تجنب أي تراكم في الزوايا أو بواسطة الغطاء. تستغرق هذه العملية برمتها حوالي 5 دقائق.
   2. عندما يتكاثف الخليط إلى "حبة" من الدهون ، قم بتوجيهه إلى وسط القارورة عن طريق تغيير زاوية القارورة. بمجرد أن تبدأ الخرزة في أن تصبح أصغر ، ارفع تيار النيتروجين قليلا لتفريق الخرزة ، مما يضمن عدم خروج أي من الدهون من القارورة.
3. قم بإزالة أي كلوروفورم متبقي تحت الفراغ.
   1. ضع القارورة الزجاجية على فراغ المنزل أو مضخة تفريغ الحجاب الحاجز لمدة 1 ساعة لإزالة غالبية الكلوروفورم المتبقي. هذه المكانس بشكل عام ليست قوية بما يكفي لإزالة كل الكلوروفورم ، لكنها يمكن أن تتحمل كميات صغيرة من المذيبات بشكل أفضل من المكانس الدوارة.
   2. ضع قارورة على مكنسة كهربائية قوية (<1 mTorr) لمدة 12-16 ساعة لإزالة جميع الكلوروفورم المتبقي. تأكد من تجنب ارتطام القارورة أثناء هذه العملية.
4. أعد تعليق الدهون في 1.25 مل من المخزن المؤقت للجسيمات الشحمية (50 ملي هيبس كوه درجة الحموضة 7.5 ، 15٪ جلسرين ، 1 ملي DTT). كما بدأنا ب 25 ملغ من الدهون ، ينتج عن هذا تركيز 20 مجم / مل. أعد تعليق الدهون بالكامل بدون قطع مرئية. إذا كانت الدهون مجمعة في زاوية القارورة ، فقد تكون هذه عملية طويلة.
   1. دوامة القارورة بقوة حتى تصبح العينة ناعمة حليبية. نجد أنه إذا تم تبخر الكلوروفورم بشكل صحيح في الليلة السابقة ، فإن هذه العملية تستغرق حوالي 5-10 دقائق.
   2. لضمان إعادة التعليق الكامل للدهون ، قم بالتدوير على عجلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات عند ~ 80 دورة في الدقيقة. قم بإزالة القارورة من العجلة مرة كل ساعة لمدة 1 دقيقة من الدوامة لضمان الخلط المتساوي.
5. انقل الدهون بعناية إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. قم بإجراء 5 دورات تجميد وإذابة باستخدام النيتروجين السائل للتجميد وكتلة حرارية 30 درجة مئوية لإذابة الجليد. تساعد هذه الخطوة على تحويل الحويصلات متعددة الصفائح إلى حويصلات أحادية الصفيحة.
6. بثق الدهون.
   1. أثناء دورات التجميد والذوبان ، قم بإعداد الطارد الصغير. قم بتجميع الطارد الصغير مع دعامات مرشح 10 مم وغشاء من البولي كربونات بحجم المسام المطلوب (نستخدم 200 نانومتر). سيؤثر حجم المرشح على حجم الجسيم الشحمي ، مما سيؤثر على تركيز البروتينات المطلوبة لإعادة التكوين (الخطوة 2.3).
   2. ضع الطارد الصغير على لوح ساخن وارفع درجة حرارة الطارد إلى 60 درجة مئوية.
   3. ارسم الدهون في حقنة زجاجية محكمة الغلق بالغاز سعة 1 مل وضعها بحذر في أحد طرفي الطارد الصغير. ضع المحقنة الفارغة محكمة الغلق بالغاز في الجانب الآخر من الطارد الصغير. اسمح للدهون بالتوازن مع درجة حرارة حامل الطارد لمدة 5-10 دقائق.
   4. انقل الدهون إلى المحقنة البديلة عن طريق دفع مكبس المحقنة المملوءة برفق. ادفع المحلول من المحقنة البديلة إلى المحقنة الأصلية. كرر هذه العملية ذهابا وإيابا 15 مرة ، بحيث تنتهي الدهون في المحقنة البديلة عند 15 مرة. راقب مستوى الصوت في كل تمريرة للتأكد من عدم وجود تسريبات.
7. قم بإعداد كميات من الدهون ذات الاستخدام الواحد ، وتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. الجسيمات الشحمية مستقرة عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. تتطلب عمليات إعادة التشكيل 10 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية في المرة الواحدة (الخطوة 2.3.4) ، لذلك من الملائم تحضير 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.

فئة

2. إعادة تكوين Msp1 وبروتين TA النموذجي

1. تحضير المخزن المؤقت لإعادة التكوين: 50 ملي مولار هيبس درجة الحموضة 7.5 ، 200 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 7 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 2 ملي مولار DTT ، 10٪ سكروز ، 0.01٪ أزيد الصوديوم ، 0.2-0.8٪ ديوكسي بيج تشابس (DBC).
   1. تحسين ظروف إعادة التكوين للدفعة الجديدة من الجسيمات الشحمية. يختلف تركيز DBC والخبيبات الحيوية المطلوبة لإعادة التكوين الأمثل اعتمادا على مجموعة الجسيمات الشحمية المستخدمة. للحد من تباين الإعداد إلى الإعداد، استخدم نفس الكمية من DBC لجميع التجارب. عند تغيير الكثير من DBC ، كرر عملية التحسين.
   2. قم بإعداد سلسلة من عمليات إعادة التكوين بتركيزات مختلفة من DBC (0.2٪ - 0.8٪) والخبيبات الحيوية (25 مجم - 100 مجم) في كل مرة يتم فيها تحضير دفعة جديدة من الجسيمات الشحمية. من المهم عدم إسقاط DBC إلى ما دون تركيز المذيلات الحرج (CMC) البالغ ~ 0.12٪. بمجرد تحسين الظروف ، نوصي بجمع جميع البيانات باستخدام نفس شروط إعداد الجسيمات الشحمية وإعادة التكوين.
   3. فحص فعالية شروط إعادة التكوين المختلفة باستخدام مقايسة الاستخراج الموضحة في الخطوة 3.
2. تحضير الخرزات الحيوية بتركيز نهائي 250 مجم / مل.
   1. قم بوزن 2.7 جم من الخبيدات الحيوية المجففة وأعد تعليقها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل من الميثانول بنسبة 100٪ (حوالي 45 مل) لترطيب الخرز. في البداية بلل الخرزات الحيوية في الميثانول لمنع الهواء من الوقوع في مسام الخرز. بمجرد دخولها إلى الميثانول ، حافظ على الخبيبات الحيوية رطبة لأن أي هواء محبوس بواسطة الخرزات الحيوية سيغير قدرتها على امتصاص المنظفات.
   2. قم بإزالة الميثانول عن طريق غسل الخرزات 8x بحوالي 45 مل من الماء فائق النقاء (18.2 mΩ) ، ويشار إليه فيما يلي باسم ddH₂O. حبات الحبيبات عن طريق الدوران عند 3,200 × جم لمدة دقيقة واحدة. صب السائل وإعادة تعليقه في ddH₂O.
   3. بعد الغسيل ، أعد تعليقه في 10 مل من ddH₂O مع 0.02٪ أزيد الصوديوم وتخزينه في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الخبيبات الحيوية في درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر. هذا المخزون هو 250 مجم / مل حيث يفترض أن ~ 0.2 جم يضيع أثناء خطوات الغسيل.
3. احسب حجم الجسيم الشحمي والعدد المطلوب من جزيئات بروتين TA و Msp1 لكل جسيم شحمي. سيحدد هذا تركيز بروتين Msp1 و TA المطلوب لإعادة التكوين.
   1. أولا ، احسب عدد جزيئات الدهون لكل جسيم شحمي أحادي الصفيحة (_إجمالي N) باستخدام المعادلة
      
      حيث D هو قطر الجسيم الشحمي ، و h هو سمك الطبقة الثنائية ، و a هي منطقة مجموعة الرأس الدهنية.
      1. قم بقياس قطر الجسيمات الشحمية بواسطة DLS. في مثالنا ، تم الحصول على قيمة 70 نانومتر لقطر الجسيم الشحمي (د).
      2. استخدم قيمة 5 نانومتر ل h و 0.71 نانومتر² ل a ، وهو حجم مجموعة الرأس للفوسفاتيديل كولين. في هذه الحالة بالذات ، _{يبلغ إجمالي} N 37,610.
   2. بعد ذلك ، احسب التركيز المولي للدهون M_Lipid باستخدام متوسط الوزن الجزيئي للدهون في الخليط. في هذا المثال ، يبلغ تركيز الدهون 20 مجم / مل (الخطوة 1.4) ومتوسط الوزن الجزيئي للدهون 810 جم / مول (الجدول 1). ينتج عن هذا قيمة 0.0247 M ل _{M Lipid}.
   3. بعد ذلك ، احسب التركيز المولي للجسيمات الشحمية ، M_Liposome ، باستخدام المعادلة
      
      حيث _{M Lipid} هو التركيز المولي للدهون من الخطوة 2.3.2 ، و _{N الإجمالي} هو العدد الإجمالي للدهون لكل جسيم شحمي محسوب في الخطوة 2.3.1. في هذا المثال ، يبلغ تركيز مخزون الجسيمات الشحمية 20 مجم / مل حوالي 660 نانومتر.
   4. احسب كمية Msp1 و TA البروتين المطلوبة لتفاعل إعادة التكوين 100 ميكرولتر.
      ملاحظه: التركيز النهائي للدهون في إعادة التكوين هو 2 مجم / مل ، وهو تخفيف 10x من مخزون الجسيمات الشحمية. هذا يعطي تركيزا نهائيا للجسيمات الشحمية يبلغ 66 نانومتر. التركيز النهائي ل Msp1 هو 792 نانومتر ، مما يعطي ما معدله 12 نسخة إجمالية (2 سداسية وظيفية) لكل جسيم شحمي. التركيز النهائي لبروتين TA هو 660 نانومتر ، والذي يعطي في المتوسط 10 نسخ لكل شحم.
4. في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، امزج Msp1 المنقى وبروتين TA والجسيمات الشحمية معا في مخزن مؤقت لإعادة التكوين. ترتيب الإضافة هو العازلة والبروتينات والجسيمات الشحمية تأخيرا. الحجم الكلي 100 ميكرولتر. اترك الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. تنقية بروتين Msp1 و TA.
   1. استخدم بروتين TA النموذجي المميز His-Flag-Sumo-Sec22 كركيزة تحكم إيجابية عند إنشاء الفحص لأول مرة. يحتوي هذا البناء على علامة His-tag لسهولة التنقية ، وعلامة 3x-Flag للكشف عن طريق اللطخة الغربية ، ومجال Sumo لزيادة الذوبان ، و TMD لبروتين ER-TA Sec22 لإعادة التكوين والتعرف عليه بواسطة Msp1.
   2. تأكد من أن محاليل مخزون كل من Msp1 وبروتين TA تبلغ حوالي 100 ميكرومتر لتقليل تأثير N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) من تنقية البروتين على إعادة التكوين. يوجد Msp1 المنقى في 20 ملي مولار هيدروكلوريد هيدروكلوريد الصوديوم 100 ملي مولار ، 0.1 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين (TCEP) ، 0.05٪ DDM بينما يوجد بروتين TA المنقى في 50 ملي مولار تريس 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد المغنيسيوم ، 5 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول ، 10٪ جلسرين ، 0.1٪ DDM. تضمن محاليل المخزون التي تحتوي على ما يقرب من 100 ميكرومتر من بروتين TA ومونومر Msp1 أن هذه المكونات ستشكل < 5٪ من حجم إعادة التكوين النهائي ، مما يؤدي إلى تخفيف DDM أسفل CMC.
5. أضف الكمية المطلوبة من الخرزات الحيوية إلى العينة لإزالة المنظف.
   1. قم بقص طرف طرف ماصة p200 إلى قطر حوالي 1/8 بوصة بحيث يمكن أن تتناسب الخرزات مع الحافة. قم بتدوير أنبوب الخرزات الحيوية جيدا للحصول على خليط موحد وإزالة الغطاء بسرعة وزيادة الحجم قبل أن تستقر الخرزات الحيوية. انقل الخرزات الحيوية إلى أنبوب PCR فارغ.
   2. عندما تنتهي إعادة التكوين من حضانة 10 دقائق على الجليد ، استخدم طرف ماصة غير مقطوع لإزالة كل السائل من الخرزات الحيوية. ثم انقل إعادة التكوين 100 ميكرولتر إلى الأنبوب باستخدام الخرزات الحيوية. يجب أن يتم ذلك بسرعة حتى لا تحبس الخرزات الحيوية الهواء ، مما يؤدي إلى طفو الخرز.
6. اسمح لإعادة التكوين بالدوران على عجلة عند ~ 80 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
7. إزالة المواد المعاد تكوينها من الخرز الحيوي. قم بتدوير سريع في بيكوفوجج لحبيبات الخبيبات الحيوية ، ثم استخدم طرف ماصة غير مقطوع لنقل المادة المعاد تكوينها إلى أنبوب PCR نظيف. كرر هذه العملية 1-2 مرات حتى لا يتبقى حبيبات حيوية في العينة. حافظ على إعادة التكوين على الجليد.
8. قم بمسح المواد المعاد تكوينها مسبقا لإزالة أي بروتينات فشلت في إعادة تكوينها في الجسيمات الشحمية.
   1. تحضير المخزن المؤقت للاستخراج: 50 ملي مولار هيبس درجة الحموضة 7.5 ، 200 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 7 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 2 ملي مولار DTT ، 100 نانومتر كلوريد الكالسيوم.
   2. قم بموازنة أعمدة دوران الجلوتاثيون باستخدام Extraction Buffer وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. يتضمن هذا عادة 3 جولات من الغسيل باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثم الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لإزالة المخزن المؤقت.
   3. أضف 5 ميكرومتر من كل مرافق (GST-SGTA و GST-Calmodulin) إلى المادة المعاد تكوينها. سوف يرتبط هؤلاء المرافقون ب TMD لأي بروتينات فشلت في إعادة تكوينها في الجسيمات الشحمية. تم وصف تنقية المرافقين سابقا.
      ملاحظه: هؤلاء المرافقون متاحون تجاريا ، لكننا نفضل التنقية داخليا للتحكم في التكلفة والجودة. كلا البروتينين موجودان في 20 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1 ملي مولار TCEP ، ولهما تركيز مخزون حوالي 160 ميكرومتر. يتعرف SGTA على الركائز ذات TMD شديدة الكارهة للماء بينما يربط Calmodulin TMDs بكراهية ماء معتدلة. معا ، يمكن لهذا الكوكتيل المرافق التعرف على مجموعة واسعة من الركائز.
   4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج إلى المادة المعاد تكوينها ، مما يصل الحجم إلى 200 ميكرولتر. أضف هذا إلى أعمدة دوران الجلوتاثيون المتوازنة. لاحظ أن أعمدة دوران الجلوتاثيون توفر أعلى استعادة للعينة عندما يكون حجم المقاصة المسبقة 200-400 ميكرولتر.
   5. قم بتوصيل أعمدة الدوران وقم بتدويرها عند ~ 80 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للمرافقين بالارتباط بالراتنج.
   6. قم بتدوير الأعمدة عند 700 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. التدفق من خلال مادة تم تطهيرها مسبقا مستنفدة من البروتينات المجمعة. احتفظ بالمواد على الجليد وتابع مباشرة في فحص الاستخراج.

< p class = "jove_title" >3. فحص الاستخراج

1. إعداد الأنابيب لتحليل SDS PAGE. سيحتوي كل تفاعل على 4 أنابيب: المدخلات (I) ، والتدفق عبر (قدم) ، والغسيل (W) ، والحذف (E).
   1. أضف 45 ميكرولتر من عينة ddH₂O إلى أنبوب الإدخال ، و 40 ميكرولتر من ddH₂O إلى أنبوب FLOW THROUGH ، و 0 ميكرولتر إلى أنابيب WASH و ELUTE .
      ملاحظه: يتم الحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء في هذا الاختبار عندما تكون عينات WASH و ELUTE مركزة بمقدار 5x بالنسبة لعينات الإدخال والتدفق من خلال. نظرا للتخفيفات أثناء الفحص ، يتطلب ذلك أخذ 5 ميكرولتر من العينة لعينة INPUT ، و 10 ميكرولتر من العينة لعينة FLOW THROUGH ، و 50 ميكرولتر من العينة لعينات WASH و ELUTE .
   2. أضف 16.6 ميكرولتر من 4x SDS PAGE Loading Buffer إلى كل أنبوب. الحجم الإجمالي لكل عينة هو 50 ميكرولتر قبل SDS PAGE Loading Buffer. الحجم النهائي هو 66.6 ميكرولتر (عينة 50 ميكرولتر + 16.6 ميكرولتر من 4x SDS PAGE Loading Buffer).
2. قم بتجميع مقايسة الاستخراج.
   1. تحضير تفاعل الاستخراج الذي يحتوي على 60 ميكرولتر من البروتينات التي تم تطهيرها مسبقا ، و 5 ميكرومتر من GST-SGTA ، و 5 ميكرومتر من GST-Calmodulin ، و 2 ملي مولار ATP. اجمع بين جميع الكواشف باستثناء ATP ، والذي يستخدم لبدء التفاعل. يصل إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر مع Extraction Buffer.
      ملاحظه: نظرا لاستخدام 60 ميكرولتر من العينة لكل مقايسة استخراج ، يمكن استخدام إعادة تكوين واحدة لثلاثة فحوصات استخراج مختلفة. قم بإجراء ضوابط إيجابية وسلبية (+ ATP و -ATP) على مواد من نفس إعادة التكوين.
   2. فحص الاستخراج قبل التسخين في كتلة حرارية 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
3. ابدأ مقايسة الاستخراج عن طريق إضافة ATP إلى التركيز النهائي البالغ 2 ملي مولار وبدء المؤقت.
   1. قم بتدوير لمدة 5 ثوان في بيكوفوج لخلط ATP في التفاعل. احتضان التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. أثناء الحضانة ، خذ 5 ميكرولتر من التفاعل وأضفه إلى أنبوب الإدخال. توقيت هذا مرن.
   3. خلال فترة الحضانة هذه ، قم بموازنة عمود دوران الجلوتاثيون واحد لكل عينة في مقايسة الاستخراج.
4. قم بإجراء السحب لأسفل على المرافقين لعزل المواد المستخرجة.
   1. بمجرد الانتهاء من الحضانة لمدة 30 دقيقة ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن الاستخراج المؤقت إلى الأنبوب ليصل الحجم الإجمالي إلى 400 ميكرولتر.
   2. قم بتدوير الأعمدة عند 700 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لتجميع التدفق من خلال. خذ 10 ميكرولتر لأنبوب FLOW THROUGH. تحتوي هذه العينة على ركائز لا تزال مدمجة في الطبقة الدهنية الثنائية.
   3. اغسل الراتنج مرتين باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج ، وتخلص من التدفق من خلاله. في الغسيل الثالث ، حافظ على التدفق وخذ 50 ميكرولتر لأنبوب الغسيل.
   4. قم بإعداد 5 مل من Elution Buffer عن طريق إضافة الجلوتاثيون المخفض إلى التركيز النهائي البالغ 5 ملي مولار في المخزن المؤقت للاستخراج. قم بإعداد هذا المخزن المؤقت طازجا في كل مرة.
   5. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى عمود الدوران. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تدور عند 700 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للاستئراق. حافظ على التدفق من خلال. كرر العملية مرة ثانية بحيث يكون إجمالي حجم الشطف 400 ميكرولتر.
   6. خذ 50 ميكرولتر من العينة من عينة Elution وأضفها إلى أنبوب ELUTION.

الدهون الخلد٪ ميغاواط متوسط ميغاواط ميكرومول في 25 مجم ملغ في 25 ملغ مخزون الكلور (ملغم/مل) ميكرولتر لمدة 25 مجم كمبيوتر شخصي 48٪ 770 369.6 دولار 14.82 دولار 11.41 دولار 25 456.4 [إ] PE 28٪ 746 208.88 8.64 دولار 6.45 دولار 25 258.0 باي 10٪ 902 ح. 90.2 3.09 دولار 2.78 دولار 10 278.5 دولار المنشطات 10٪ 810 دولار 81 3.09 دولار 2.50 دولار 10 250.1 دولار TOCL 4٪ 1502 60.08 1.23 [م] 1.85 دولار 25 74.2 [إ] Conc. Corr متوسط ميغاواط < TD colspan = "4" >809.76 ميكرومول في 25 مجم < td colspan = "4" >30.87

الجدول 1: عينة من الحسابات لتحضير الجسيمات الشحمية. تتمثل الأهداف الرئيسية لهذا الجدول في حساب متوسط الوزن الجزيئي المصحح للتركيز لخليط الدهون وحجم كل مخزون دهني مطلوب لصنع الجسيمات الشحمية. يأتي تركيز MW والمخزون من ملصقات المنتج. يتم اختيار الدهون والشام٪ من قبل المستخدم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الخرزات الحيوية بيو راد 1523920 كبد البقر فوسفاتيديل الإينوزيتول افانتي 840042ج باي دجاج بيض فوسفاتيديل كولين افانتي 840051 ج كمبيوتر شخصي بيض دجاج فوسفاتيديل إيثانولامين افانتي 840021 ج PE يدعم المرشح افانتي 610014 قارورة زجاجية VWR 60910 لتر-1 عمود الجلوتاثيون تدور ثيرمو فيشر PI16103 الطارد الصغير افانتي 610020 الاصطناعية 1 ، 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine افانتي 840035ج المنشطات اصطناعي 1 '، 3'-مكرر [12-ديولويل-سنجليسيرو-3-فوسفو]-جلسرين افانتي 710335 ج TOCL حقنة 1 مل نورم جيكت 53548-001 حقنة 1 مل محكم الغاز أفانتي 610017