مقايسة β-Galactosidase لتقييم السمية الخلوية التي يسببها الدواء في الطفيليات

الملخص

المصدر: Alonso, V. L. et al. في المختبر فحص الأدوية ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبية الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase. J. Vis. exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة بسيطة وقوية لتحديد الإمكانات السامة للخلايا لدواء مبيد المثقبيات ضد طفيلي ، المثقبية الكروزية ، معبرا عن إنزيم β-galactosidase. يعمل β-galactosidase كمؤشر لتحلل الخلايا ، ويمكن استخدام نشاطه لتقييم تأثيرات الدواء.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص β-galactosidase

ملاحظة: يتم استخدام التقدير الكمي لنشاط β-galactosidase كطريقة غير مباشرة لتحديد عدد الطفيليات. من المتوقع أن يتم تثبيط النمو في وجود مركب مبيد المثقبيات ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد الطفيليات مقارنة بالسيطرة غير المعالجة ، مما سينعكس في نشاط أقل β-galactosidase وبالتالي امتصاص أقل.

1. احتضان الطفيليات مع BZN
   1. أضف 100 ميكرولتر من محلول 2x benznidazole (BZN) المقابل لكل بئر للوصول إلى التركيز النهائي ل BZN من 80 و 40 و 20 و 10 و 5 و 2.5 ميكرومتر إلى 100 ميكرولتر من معلق epimastigote ، أو خلايا Vero مع amastigotes (بعد يومين من الإصابة) ، أو المثقبيات في صفيحة 96 بئر.
   2. احتضان epimastigotes عند 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، والحبيبية أو خلايا Vero المصابة ب amastigotes لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
      ملاحظه: يجب تقييم كل تركيز دواء على الأقل في ثلاث نسخ ويشمل مزارع التحكم في epimastigotes ، والمثقبيات ، وخلايا Vero المصابة بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
2. تفاعل اللونية
   1. بعد فترة حضانة العلاج ، إذا كانت خلايا Vero المصابة أو المثقبيات المصابة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco باللون الأحمر الفينول ، فاستبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من 1x PBS لتجنب التداخل. قم بإجراء آبار فارغة ثلاثية تحتوي على 100 ميكرولتر فقط من الوسط المقابل (أو 1x PBS حسب الاقتضاء).
      ملاحظه: ليس من الضروري إزالة وسط الثقافة لepimastigotes في حالة وسط LIT أو DMEM بدون أحمر الفينول. لا يزال من الممكن استخدام DMEM مع الفينول الأحمر ؛ قم بإعداد بئر فارغ باستخدام DMEM وحده لقياس امتصاص القاعدة ثم طرح هذه القيمة أثناء تحليل البيانات. وسط حشرات شنايدر ، عديم اللون ، هو بديل لepimastigotes.
   2. أضف 40 ميكرولتر من محلول الركيزة الأحمر الكلوروفينول β-D-galactopyranoside (CPRG) و 10 ميكرولتر من محلول المنظف لكل بئر ، للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر CPRG و 0.1٪ منظف في حجم نهائي قدره 250 ميكرولتر في كل بئر.
      ملاحظه: يمكن إضافة محلول CPRG والمنظف معا في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر لكل بئر.
   3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين وقياس الامتصاص عند 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي المجهري.
      ملاحظه: التغير المتوقع في اللون هو الأصفر إلى البني المحمر عند الانقسام الأنزيمي β-galactosidase (الشكل 1 أ). يمكن تمديد وقت الحضانة حتى 4 ساعات ، ويمكن قراءة أطياف امتصاص الكلوروفينول الأحمر بين 570 و 595 نانومتر مع تركيب منحنى مماثل. أظهرت الحضانة لمدة تصل إلى 24 ساعة في وجود ركيزة CPRG تركيبات منحنى مماثلة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: حساب قيمة IC50 للبنزنيدازول لشكل epimastigote Dm28c. (أ) صفيحة مكونة من 96 بئرا مع epimastigotes معالجة بتركيزات مختلفة من BZN (2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 ميكرومتر) قبل إضافة CPRG (1) ، بعد الإضافة الأولية ل CPRG والمنظفات (2) ، وبعد الحضانة مع CPRG والمنظفات التي تظهر تغير اللون (3). (ب) مخطط XY للتركيزات اللوغاريتمية ل BZN مقابل الامتصاص (OD) ع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 أطباق بئر كورنينج 3599 [إ] بنزنيدازول سيجما ألدريتش 419656 5 مل ماصة مصلية معقمة جيت بيوفيل GSP010005 10 مل ماصة مصلية معقمة جيت بيوفيل GSP211010 خزانة السلامة الحيوية تلستار السيرة الذاتية الثاني A / P CPRG روش 10 884308001 الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside DMEM, نسبة عالية من الجلوكوز ثيرمو فيشر سينتيفيك 12100046 ذرور DMSO سينتأورجان الخطي: 061 ثنائي ميثيل سلفوكسيد مصل ربلة الساق الجنينية Internegocios SA FCS FRA 500 معقمة ومعطلة بالحرارة خلايا فيرو ATCC [رل-1587] مقياس الطيف الضوئي المجهري بيوتيك سينرجي إتش تي إكس أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل تارسون 500010-ن محلول ملح ثاني كبريتات G418 روش G418-RO تركيز المخزون: 50 مجم / مل