اختبار قائم على اللوحة لقياس إطلاق أحادي الأمين من شرائح الدماغ عند اختبار التعرض للأدوية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Pino ، J. A. et al. اختبار قائم على اللوحة لقياس إطلاق أحادي الأمين الداخلي في شرائح الدماغ الحادة. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نعرض اختبارا يبحث في آليات إطلاق أحادي الأمين من الخلايا العصبية لشرائح دماغ الفئران النشطة الأيضية خارج الجسم الحي ، عند معالجتها بأدوية الاختبار. يوضح الاختبار أن الأدوية المنشطة العصبية تحفز إطلاق أحادي الأمين عبر ناقلات أحادي الأمين الخلوية ، في حين أن التركيز العالي على KCl يحفز إطلاق أحادي الأمين الحويصلي بوساطة إفراز الحويصلة المشبكية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. إطلاق أحادي الأمين الداخلي خارج الجسم الحي من شرائح الدماغ أو اللكمات

ملاحظة: يتكون الجهاز المستخدم في هذا القسم من صفيحة 48 بئرا وحامل مناديل مصنوع من ست وحدات مرشح للطرد المركزي الدقيق بدون مرشحات داخلية متصلة بخط كربوجين (الشكل 1). لصنع الحامل ، استخدم قضيبا بلاستيكيا قويا (على سبيل المثال ، من مكشطة خلية) وقم بلصق وحدات مرشح أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بدون المرشحات الداخلية له. اتركه يجف لمدة 1-2 أيام. ويستند الوقت اللازم لتجربة إطلاق أحادي الأمين الداخلي وتركيزات الأمفيتامين والفلوكستين والكوكايين إلى الأدبيات الحالية والبروتوكولات السابقة.

1. تنشيط الأنسجة
   1. انقل أنسجة المخ إلى كل بئر من غرفة التدفق واسمح بالتعافي لمدة 30-50 دقيقة عند 37 درجة مئوية على جهاز تسخين منزلق في 0.5-1 مل من المخزن المؤقت للتدفق المؤكسج ، مع فقاعات مستمرة ولطيفة (الشكل 1B1).
   2. خلال هذه الحضانة ، قم بتخفيف الأدوية إلى التركيز المطلوب للتجربة. يجب إذابة جميع الأدوية في مخزن التدفق المؤقت ، وتستند التركيزات إلى الأدبيات الحالية.
2. الحضانة الأولى
   1. انقل حامل المناديل مع أنسجة المخ إلى آبار تحتوي على 500 ميكرولتر من عازلة التدفق المؤكسج واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من نقل الحد الأدنى من المخزن المؤقت أو معدومه عن طريق النقر على الحامل الموجود على حافة البئر حتى لا يكون هناك عازل زائد في الحامل.
   2. في التجارب مع العوامل الدوائية مثل مثبطات ناقل أحادي الأمين ، احتضان عينات الأنسجة بالأدوية المخففة في مخزن التدفق المؤكسج (على سبيل المثال ، 10 ميكرومتر فلوكستين ، 40 ميكرومتر كوكايين ؛ انظر الشكل 1 ب 2). سيكون الحجم النهائي في كل بئر 500 ميكرولتر.
3. الحضانة الثانية
   1. انقل الحامل مع الأنسجة إلى مجموعة جديدة من الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق الكلي مع أو بدون التركيز المطلوب لكل دواء. تأكد من عدم وجود مخزن مؤقت زائد متبقي. يمثل كل بئر n = 1 للظروف التجريبية. يتم تنفيذ كل حالة تجريبية في ثلاث نسخ.
   2. يشتمل أحد البئر على مخزن مؤقت للتدفق المؤكسج ، وهو 10-30 ميكرومتر AMPH التالي ، ويتضمن البئر الأخير 10-30 ميكرومتر AMPH بالإضافة إلى مثبطات ناقل أحادي الأمين. يتم إذابة كل دواء في مخزن مؤقت للتدفق المؤكسج.
   3. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 500 ميكرولتر من حالة الدواء.
      ملاحظه: قد تشتمل الآبار الإضافية على مخزن مؤقت عالي التدفق K + مؤكسج مع أو بدون مثبطات ناقل أحادي الأمين. قم بإذابة كل دواء في مخزن التدفق المؤكسج (500 ميكرولتر).
   4. خلال هذه الحضانة الثانية لمدة 20 دقيقة ، اجمع المحلول من الآبار من الحضانة الأولى في الخطوة 1.2.1 وانتقل إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من 1 نيوتن حمض بيركلوريك أو حمض الفوسفوريك (يعتمد على نوع HPLC ، التركيز النهائي 0.1 نيوتن). سيكون الحجم النهائي للعينة 550 ميكرولتر ، حافظ على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد وقم بتسمية الأنابيب # 1.
   5. بعد الحضانة الثانية لمدة 20 دقيقة ، انقل حامل الأنسجة مع أقسام الدماغ أو اللكمات إلى بئر فارغ وحافظ على اللوحة على الجليد. نقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 1 نيوتن أو حمض الفوسفوريك. سيكون الحجم النهائي للعينة 550 ميكرولتر ، حافظ على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد وقم بتسمية الأنابيب # 2.
   6. أضف 1 مل من محلول تشريح الثلج البارد إلى كل بئر يحتوي على نسيجة. اجمع كل الأنسجة باستخدام ملاقط صغيرة ، وانقلها لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
   7. حافظ على الأنابيب مع أنسجة المخ عند -80 درجة مئوية. تخلص من 1 مل من المخزن المؤقت للتشريح (الشكل 1B4).
   8. محاليل التصفية التي تم الحصول عليها من كل حضانة باستخدام أنابيب ترشيح أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (0.22 ميكرومتر) عند 2,500 × جم لمدة دقيقتين. استخدم المرشح لتحديد محتوى أحادي الأمين باستخدام HPLC مع الكشف الكهروكيميائي (الشكل 1B5).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: الإعداد التجريبي لتجربة التدفق. (أ) تتكون غرفة التدفق من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا وصينية حامل مناديل متصلة بخط الكربوجين. (ب) رسم تخطيطي يوضح التصميم التجريبي لتجربة تدفق أحادي الأمين الداخلي حيث يتم عرض تنشيط الأنسجة (B1) ، والحضانة المسبقة مع / بدون مثبطات ناقل أحادي الأمين (B2) ، وتجربة التدفق (B3)...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 48 بئر لوحة غير أ غير أ تحليل كلوريد الكالسيوم اللامائي سيجما ألدريتش سي 1016 السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المعدل أو عازلة التدفق د- (+) - جلوكوز سيغما 1002608421 المخزن المؤقت للتشريح حمض الأسكوربيك سيجما ألدريتش أ 5960 المخزن المؤقت للتشريح كبريتات المغنيسيوم سيغما 7487-88-9 KH العازلة وحدات تصفية أجهزة الطرد المركزي الدقيقة UltraFree ميليبور سي 7554 الفحص - 6 لتناسب لوحة 48 بئرا بارجيلين كلوروهيدرات سيجما ألدريتش ص 8013 السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المعدل أو عازلة التدفق كلوريد البوتاسيوم سيغما هاتف 12636 KH العازلة فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة سيغما 1001655559 KH العازلة بيكربونات الصوديوم سيغما الطراز S5761 المخزن المؤقت للتشريح بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش الطراز S5761 المخزن المؤقت للتشريح كلوريد الصوديوم سيغما S3014 KH العازلة