فحص التكلس لقياس تركيز الكالسيوم في الخلايا الخلالية للصمام الأبهري

الملخص

المصدر: Bouchareb، R. et al.، عزل خلايا الصمام الخلالي للفأر لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر.J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية فحص لتقييم تكلس الخلايا الخلالية للصمام الأبهري في المختبر. يساعد الاختبار على تحديد تركيز الكالسيوم باستخدام كاشف الزرسينازو III ، وهو صبغة حساسة للكالسيوم تتفاعل مع أيونات الكالسيوم لتشكيل مركب الكالسيوم والزرسينازو الأرجواني اللون.

البروتوكول

< p class = "jove_content" >تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة التطوير والاستخدام المؤسسية في Mount Sinai.

< p class = "jove_title" >1. التحضير قبل عزل خلية الصمام من الفئران البالغة

1. قم بتنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية الموضحة في الشكل 1 أ باستخدام 70٪ من الإيثانول الحجمي الحجمي ثم تعقيمها لمدة 30 دقيقة ، وتنظيف مساحة العمل الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. أضف 500 ميكرولتر من البنسلين والستربتومايسين إلى 50 مل من 10 مم HEPES. قم بإعداد كمية 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). احتفظ بالحلول على الجليد.
3. قم بإعداد محاليل الكولاجيناز 1 مجم / مل و 4.5 مجم / مل واستخدم 5 مل من كل محلول في أنابيب سعة 15 مل لإجراء الإجراء بأكمله. لتحضير 5 مل من 1 ملغم/مل من الكولاجيناز، اخلطي 5 ملغ من الكولاجيناز مع 2.5 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM، مصل الأبقار الجنيني الخالي من FBS)) و2.5 مل من 10 مللي من HEPES المكمل بالمضادات الحيوية (1٪ بنسلين-ستربتومايسين من الخطوة 1.2). قم بتصفية المحاليل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي تلوث.
   ملاحظة: احتفظ بالمحاليل على الثلج لحماية الإنزيمات.
4. قم بتسخين محلول DMEM إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامه في جميع الخطوات الموضحة أدناه. تحضير وسط كامل عن طريق مكملات DMEM ب 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، 5 مل من 200 ملي مولار ل-جلوتامين ، 1 مل من كاشف التخلص من الميكوبلازما (انظر جدول المواد) ، و 10٪ FBS.

فئة

2. عزل خلايا الصمام

1. للحصول على 10⁵ خلايا للتجربة ، استخدم خمسة فئران عمرها 8 أسابيع (ثلاثة على الأقل). ضع الفأر في غرفة الحث مع قطعة صغيرة من المناديل الورقية مبللة ب 1 مل من الأيزوفلوران ، لكن لا تسمح بملامسة الأنسجة. للتأكد من أن مخدر تماما ؛ تحقق من رد فعل قرصة إصبع القدم ، ثم قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم. استخدم الأيزوفلوران لتخفيف أي ألم قبل خلع عنق الرحم لأن الإجراء الموضح أدناه نهائي.
2. ضع الماوس على منصة تشريح ، وقم بتثبيت الكفوف بالقنيات لتثبيتها في مكانها. تنظيف الصدر والبطن بالإيثانول. افتح البطن والصدر بالمقص. باستخدام مقص جراحي صغير ، اقطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر لإخراج الفأر. قم بدمج القلب ب 10 مل من البرد 1x PBS لإزالة الدم من القلب.
3. اقطع القلب واحتفظ ب 3 مم من الشريان الأورطي الصاعد كما هو موضح في الشكل 1 ب. تشريح الصمام الأبهري تحت مجهر مجسم. اقطع القلب أفقيا في منتصف البطينين (الشكل 1 ج). اقطع البطين الأيسر باتجاه الشريان الأورطي ، وقم بتشريح الصمام الأبهري بعناية (الشكل 1D-F). قم بتجميع الصمامات معا في طبق صغير لزراعة الأنسجة مقاس 35 مم.
4. اغسل الصمامات المعزولة في طبق زراعة الخلايا مقاس 75 مم مع 5 مل من HEPES البارد (10 ملم) مكمل بالمضادات الحيوية (1٪ بنسلين - ستربتومايسين) لإزالة الدم (الشكل 2). قم بإعداد أنبوبين سعة 15 مل من الكولاجيناز 1 مجم / مل و 4.5 مجم / مل كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3.
   ملاحظه: بعد التشريح ، قم بمعالجة الصمامات المعزولة في غطاء أمان حيوي معقم لتقليل التلوث.
5. احتضان الصمامات في النوع الكولاجينيزي الأول (1 مجم / مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر (الشكل 2). قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، واغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 2 مل من HEPES (10 مل) ، ودوامة لمدة 30 ثانية بسرعة عالية. صب محتويات هذا الأنبوب في طبق استزراع 35 مم ، وانقل شظايا الأنسجة بعناية باستخدام ملاقط رقيقة إلى أنبوب جديد.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، لا تزال VICs غير منفصلة عن الأنسجة ، وتحتوي الحبيبات على قطع من الأنسجة. لتجنب التلوث بالخلايا البطانية ، لا تستخدم أجهزة الطرد المركزي بعد الدوامة في الخطوة 2.5.
6. احتضان الحبيبات في أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من الكولاجيناز من النوع الأول (4.5 مجم / مل) عند 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 35 دقيقة. أعد تعليق الخلايا بماصة 1 مل لفصل الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من DMEM الكامل. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين لتنظيف الخلايا.
   ملاحظه: ستظل الحبيبات تحتوي على بعض شظايا الأنسجة.
8. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط الكامل ، وقم بوضع الخلايا في بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا المكون من 6 آبار في الحد الأدنى من الوسط لتسهيل ارتباطها بطبق الاستزراع. اترك الخلايا ، دون إزعاج ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
9. بعد 3 أيام ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتحقق من النمو الجيد بالقرب من بقايا الأنسجة. بمجرد ظهور 1,000 خلية تحت المجهر ، قم بإزالة بقايا الأنسجة بعناية باستخدام ملاقط معقمة ، وقم بتغيير الوسط.
   ملاحظه: لا ينبغي إزعاج اللوحة. إذا لم يتم ملاحظة العدد المطلوب من الخلايا ، فضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة يومين آخرين.
10. عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 70٪ (2.5 × 10⁵) ، قم بالتربسين ثم نقلها إلى طبق زراعة أنسجة 75 مم.

< p class = "jove_title" >3. فحص التكلس في المختبر

1. نظف الشفاط بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بتسخين وسط DMEM إلى 37 درجة مئوية.
2. زرع 100,000 خلية / حالة في 6 ألواح في DMEM كاملة ، وزراعت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
3. تحضير وسط التكلس عن طريق خلط 2 ملي مولار من NaH₂PO₄ و 10-7 M الأنسولين و 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك في DMEM مع 5٪ FBS. للحصول على 93 مل من DMEM ، أضف 5 مل من FBS ، و 1 مل من المضادات الحيوية (التركيز النهائي 1٪) ، و 1 مل من بيروفات الصوديوم (100 ملي مو) ، و 27.5 مجم من NaH₂PO₄ ، و 5.8 ميكرولتر من الأنسولين ، و 5 مجم من حمض الأسكوربيك><. ملاحظة: قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
4. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط الطافي بوسط التكلس. احتضان الخلايا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثالث ، استبدلها بوسط تكلس طازج ، ثم ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لإكمال 7 أيام من العلاج.
5. بعد 7 أيام ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من 1x PBS. احتضان الخلايا في 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.6 نيوتن (HCl) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. اجمع حمض الهيدروكلوريك في أنبوب سعة 1.5 مل ، وتبخره في مبخر دوار. أعد تعليق محتويات جميع الأنابيب في 60 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك
   ملاحظه: إجراء التجفيف مهم لتركيز المحلول والحصول على نفس الحجم لكل حالة.
6. استخدم صفيحة ذات 96 بئرا لقياس تركيز الكالسيوم باستخدام كاشف Arsenazo III ، المتوفر في مجموعة جاهزة للاستخدام (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل).
7. تحضير محلول قياسي للكالسيوم بتركيز 10 مجم / ديسيلتر. تزن 10 مجم من هيدروكسيد الكالسيوم (Ca (OH) ₂) وتذوب في 100 مل من الماء المقطر.
8. في صفيحة واضحة 96 بئر ، ماصة 2 ميكرولتر من محلول فارغ (حمض الهيدروكلوريك ، 0.6 نيوتن) ، المحلول القياسي ، العينة لكل بئر (10 مجم / ديسيلتر) ، والعينات. قم بإجراء التجربة ثلاث نسخ للتحقق من تباين سحب العينات. أضف 200 ميكرولتر من الكاشف لكل شرط.
   ملاحظه: يجب تخفيف العينات التي تزيد عن 15 مجم / ديسيلتر بنسبة 1: 1 بمحلول ملحي ، وإعادة فحصها ، وضرب النتيجة في اثنين.
9. احتضان التفاعل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يكون التفاعل مستقرا لمدة 60 دقيقة.
10. اقرأ وسجل امتصاص اللوحة عند 650 نانومتر. استخدم الصيغة التالية لحساب كمية الكالسيوم في العينات:
    الكالسيوم (ملغ / مل) = (امتصاص العينة / امتصاص المعيار) × تركيز المعيار

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: وصف تشريح الصمام. (أ) صورة تمثيلية لجميع الأدوات الجراحية اللازمة للتشريح ، هناك حاجة إلى مقص 2 لفتح جلد الماوس والمقص 3 لفتح الصدر. هناك حاجة إلى ملاقط 5 و 6 لتثبيت الجلد وفتح الصدر. (ب) اترك 3 مم من الأنسجة من الشريان الأورطي (السهم الأسود). (ج) قطع القلب في منتصف البطينين بالمقص رقم 4. (د) افتح القلب باتجاه الص...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقص حافة القطع 3 مم ف.س.ت 15000-00 مجموعة كاشف Arsenazo-III بوينت ساينتيك سي 7529-500 مجموعة لقياس تركيز الكالسيوم مقص بون ف.س.ت 14184-09 هيدروكسيد الكالسيوم سيجما - ألدريتش 31219 الكولاجيناز النوع الأول (125 وحدة / مجم) ثيرموفيشر العلمي 17018029 DMEM Tthermofisher 11965092 ملقط غرايف ناعم للغاية ف.س.ت 11150-10 FBS جيبكو 16000044 ملقط ناعم إف إس تي دومون حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش H1758 محلول HEPES 1 M تقنيات الخلايا الجذعية L-الجلوتامين 100x ثيرموفيشر العلمي A2916801 برنامج تلفزيوني 10x سيجما ألدريتش البنسلين ستربتومايسين 100x ثيرموفيشر العلمي 10378016 بيروفات الصوديوم 100 ملم ثيرموفيشر العلمي 11360070 ملقط نمط قياسي ف.س.ت 11000-12 مقص جراحي - حاد حاد ف.س.ت 14008-14 التربسين 0.05٪ ثيرموفيشر العلمي 25300054