مقايسة التألق المناعي للكشف عن تلف الحمض النووي بوساطة PM2.5 في أجنة الأسماك

الملخص

المصدر: هوانغ ، واي ، وآخرون. استخدام التألق المناعي للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM_2.5 في قلوب جنين أسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو فحصا قائما على التألق المناعي شديد الحساسية للكشف عن الضرر التأكسدي الناجم عن PM_2.5 في قلوب أجنة أسماك الزرد عن طريق قياس مستويات 8-OHdG و γH2AX ، والتي تشير إلى تلف الحمض النووي وفواصل الحمض النووي المزدوجة ، على التوالي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. PM_2.5 أخذ العينات واستخراج المركبات العضوية

ملاحظة: تم جمع PM_2.5 في منطقة حضرية في سوتشو ، الصين ، من 1 إلى 7 أغسطس 2015 ، كما هو موضح سابقا.

1. اخبز مرشحات غشاء الكوارتز مقاس 47 مم في فرن دثر 500 درجة مئوية لمدة ساعتين لإزالة المكونات العضوية.
2. ضع مرشحا في جهاز أخذ العينات PM_2.5 لمدة 24 ساعة من أخذ العينات دون انقطاع.
3. قم بإزالة الفلتر وجففه لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. حدد كمية المرشح باستخدام ميزان تحليلي.
5. استخرج المكونات العضوية من المرشح عن طريق استخراج Soxhlet باستخدام ثنائي كلورو الميثان كمذيب.
6. جفف EOM عن طريق التبخر الدوار في حمام مائي 60 درجة مئوية وتدفق النيتروجين. قم بإذابة EOM في DMSO وتخزينها عند -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. جمع أجنة الزرد ومعالجتها

1. يجب الحفاظ على سمك الزرد عند 28.5 ± 0.5 درجة مئوية في نظام إعادة تدوير الاستزراع المائي مع دورة ضوئية 14 ساعة و10 ساعات مظلمة.
2. ضع سمك الزرد البالغ الصحي في حوض بنسبة 2: 1 من الذكور إلى الإناث.
3. في اليوم التالي ، اجمع الأجنة واغسلها بماء النظام (أي مياه تربية أسماك الزرد).
4. حدد وقم بتقسيم أجنة الزرد بشكل عشوائي التي تظهر نموا طبيعيا (حجم موحد ، حبوب كاملة ، وبدون تخثر للبيض) إلى 4 مجموعات في أطباق بتري زجاجية فردية بقطر 7 سم (حوالي 50 جنينا لكل طبق).
5. عالج الأجنة ب PM_2.5 (5 مجم / لتر) في وجود أو عدم وجود NAC عند 0.25 ميكرومتر من 2 hpf إلى 72 hpf. استخدم DMSO كعنصر تحكم في السيارة إلى تركيز نهائي عند 0.1٪ (حجم / حجم).

< p class = "jove_title" >3. الملاحظة المورفولوجية لأجنة الزرد وتشريح القلب

1. بقوة 72 حصانا ، انقل الأجنة إلى شرائح زجاجية وراقب تحت مجهر استريو. سجل تشوهات القلب، مثل وذمة التامور، وتغير التكرارات، وانخفاض الحجم.
2. احسب معدلات التشوه (النسبة المئوية للأجنة المصابة بعيوب في القلب من إجمالي الأجنة الحية) وتحليل الاختلافات بين المجموعات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة في تركيا (ص < 0.05 = دلالة إحصائية).
3. تخدير الأجنة ب 0.6 مجم / مل MS-222 لشل حركتها على شرائح زجاجية.
4. سجل دقات القلب لمدة 30 ثانية وحدد معدل ضربات القلب باستخدام برنامج ImageJ.
5. قم بتشريح القلوب من أجنة الزرد بإبرة حقنة يمكن التخلص منها تحت المجهر الاستريو. تحذير: تجنب تدمير شكل القلب.

< p class = "jove_title" >4. فحص التألق المناعي

1. لاستخدام مقايسة التألق المناعي للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM_2.5 في قلب أجنة أسماك الزرد ، استخدم قلم حاجز كاره للماء لرسم دائرة على جانب زجاجي نظيف.
2. أضف 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى 1.25 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لعمل محلول تثبيتي.
3. ضع 3 قلوب مشرحة في دائرة قلم حاجز واحدة كارهة للماء واحتضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. صب المحلول تحت المجهر وجفف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل ، بحيث تلتصق القلوب تماما بالشرائح الزجاجية.
5. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS مع 0.1٪ Tween 20 (PBST) لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
6. أضف 50 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 1000 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول BSA بنسبة 5٪ واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
7. صب المحلول وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
8. قم بتخفيف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ضد 8-OHdG و 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد γH2AX في 296 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول كوكتيل أساسي للأجسام المضادة العاملة.
9. احتضان عينات القلب ب 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولي ضد 8-OHdG و γH2AX في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية (يمكن أن تزيد الحضانة الليلية من شدة الإشارة).
10. صب المحلول وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
11. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر المسمى FITC و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للماعز cy3 المضاد للأرانب في 498 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية العامل واحتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية (1: 500 في PBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
12. صب المحلول وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل غسلة محمية من الضوء.
13. أضف 20 ميكرولتر من DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) إلى عينات التلوين النووي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
14. ضعي غطاء للانزلاق وإغلاقه بطلاء الأظافر لمنع الجفاف والحركة. ثم قم بتصوير العينات تحت المجهر الفلوري وحدد إشارة التألق لمنطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. احسب التغييرات النسبية بمتوسط عينات التحكم في DMSO. تحديد الدلالة الإحصائية للبيانات كما في الخطوة 3.2.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 8-OHdG الأجسام المضادة سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة الأمريكية SC-66036 الجسم المضاد الأولي الميزان التحليلي سارتوريوس ، الصين BSA124S جيش صرب البوسنه Solarbio ، بكين ، الصين SW3015 للحظر دابي Abcam ، الولايات المتحدة الأمريكية أب104139 للبقعة النووية. DMSO Solarbio ، بكين ، الصين د8371 المجهر الفلوري أوليمبوس ، اليابان IX73 لتصوير إشارات التألق الماعز المضادة للأرانب IgG Cy3 كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية سي دبليو 0159 الجسم المضاد الثانوي الماعز المضادة للأرانب IgG FITC كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية RS0003 الجسم المضاد الثانوي ن-أسيتيل-L-سيستين(NAC) Adamas-Beta ، شنغهاي ، الصين 616-91-1 شاكر المداري QILINBEIER ، الصين تي إس-1 بارافورمالدهيد سيجما ، الصين ص 6148 اصنع 4٪ بارافورمالدهيد للتثبيت. محلول ملحي مخزن بالفوسفات HyClone ، الولايات المتحدة الأمريكية SH30256.01 تحضير 0.1٪ توين في PBS للغسيل. جهاز أخذ العينات PM2.5 تيانهونغ ، ووهان ، الصين TH-150C لأخذ عينات PM2.5 دون انقطاع على مدار 24 ساعة. نظام إعادة تدوير الاستزراع المائي HaiSheng ، شنغهاي ، الصين تم الحفاظ على سمك الزرد فيه. مستخرج Soxhlet تشنغ تشياو ، شنغهاي ، الصين BSXT-02 لاستخراج المكونات العضوية. مجهر مجسمة نيكون، كندا SMZ645 لتشريح القلب من أجنة الزرد. تريكايين ميثان سولفونات (MS222) سيجما ، الصين [إ10521] لتخدير أجنة الزرد توين 20 سيجما ، الصين ص 1379 γH2AX الجسم المضاد Abcam ، الولايات المتحدة الأمريكية أب26350 الجسم المضاد الأولي