$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >1. تحضير شرائح قشرة الأنف والحصين
ملاحظة: يستخدم تحضير شرائح قشرة الأنف والحصين الفئران P6-7 Sprague-Dawley.
- إعداد الثقافة والإعداد الوسيط
- في اليوم السابق للثقافة ، قم بإعداد الوسائط المطلوبة ووضعها عند 4 درجات مئوية.
- تحضير وسط التشريح: 25 ملي مولار جلوكوز في محلول الملح المتوازن من جي (GBSS).
- تحضير وسط الاستزراع: 50٪ Opti-MEM ، 25٪ HBSS ، 25٪ مصل الحصان (HS) ، 25 ملي جلوكوز ، 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين.
- تحضير وسط الصيانة: Neurobasal-A (NBA) ، 2٪ B27 ، 1 ملي مولار L-glutamine ، 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين ، HS (15٪ ، 10٪ ، 5٪ و 0٪).
- حصاد الدماغ
- قبل بدء المزرعة مباشرة ، أضف 1.1 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة P1000 وضعها عند 37 درجة مئوية.
- ضع جميع المعدات (مجهر التشريح ، مفرمة الأنسجة ، مصباح التشريح ، أدوات التشريح ، الأقطاب الكهربائية ، الألواح ، الإدخالات ، وأوراق الترشيح) داخل خزانة السلامة البيولوجية وتعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
- اضبط سمك الشريحة إلى 350 ميكرومتر.
- اسحب GBSS من الثلاجة. أضف 5 مل من GBSS إلى ستة أطباق بتري. ستكون هناك حاجة إلى ستة أطباق بتري لكل.
- القتل الرحيم جرو الفئران. قم بقطع الرأس باستخدام مقص حاد في قاعدة جذع دماغ.
- اغسل رأس ثلاث مرات في GBSS البارد وخذه داخل خزانة الأمان.
- عزل الأنسجة وتحضير الشرائح
- أدخل ملقطا حادا بإحكام في تجويف العين لتثبيت الرأس.
- باستخدام مقص رفيع ، قم بقص الجلد / فروة الرأس على طول خط الوسط بدءا من الثقبة الفقرية باتجاه الفص الجبهي وضعه جانبا.
- قطع بنفس الطريقة الجمجمة وعلى طول الشق المستعرض الدماغي (المسافة بين الدماغ والمخيخ). باستخدام ملقط طويل منحني ، حركه بعيدا عن بعضه البعض.
- تخلص من المصابيح الشمية بملعقة. أخرج الدماغ من الرأس وضعه في GBSS شديد البرد مع توجيه السطح الظهري لأعلى (الشكل 1 أ).
- أدخل الملقط الدقيق في المخيخ واذهب على طول خط الوسط مع فتح الملعقة لكل نصف كرة بعناية فائقة (الشكل 1 ب).
- باستخدام ملقط منحنى قصير ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة التي تغطي الحصين بعناية ، دون لمس بنية الحصين. ثم باستخدام ملعقة ، اقطع أسفل كل حصين (الشكل 1 ج).
- التقط نصف الكرة الأرضية وضعه ، مع توجيه الحصين لأعلى ، على ورق ترشيح. كرر الإجراء مع نصف الكرة الآخر وضعه بالتوازي مع النصف الأول ، في ورق الترشيح. ضع ورق الترشيح على مفرمة المناديل ، بحيث يكون نصفي الكرة الأرضية عموديا على الشفرة ، وقم بقص نصفي الكرة الأرضية إلى شرائح 350 ميكرومتر (الشكل 1 د).
- ضع الأنسجة المقطعة في طبق بتري مع GBSS البارد (الشكل 1 ه).
- افصل الشرائح بعناية باستخدام أقطاب الطرف المستديرة (الشكل 1F). احتفظ فقط بالشرائح ذات قشرة الأنف والحصين السليمة هيكليا. يجب تحديد مناطق DG و CA بشكل مثالي ، وكذلك القشرة المخية الداخلية وحول الأنف (الشكل 1G).
- ضع كل شريحة على الملحق (الشكل 1H-I) ، باستخدام ملعقة وقطب كهربائي دائري. قم بإزالة وسط التشريح الزائد حول كل شريحة باستخدام ماصة P20 (الشكل 1J). يمكن استزراع أربع شرائح من قشرة الأنف والحصين في ملحق واحد (الشكل 1 ك).
- الحفاظ على الثقافة
- قم بتغيير الوسيط كل يومين.
- قم بتسخين الوسط عند 37 درجة مئوية.
- خذ الأطباق من الحاضنة. التقط كل ملحق عن طريق إمساك الحافة البلاستيكية بالملقط (الشكل 1L).
- استخدم يدا حرة لشفط الوسط من البئر. ضع الملحق مرة أخرى في البئر وأضف 1 مل ، باستخدام ماصة P1000 ، من وسط دافئ طازج (الشكل 1M). كرر لجميع الإدخالات. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة بين الغشاء والوسط.
ملاحظه: تخضع الشرائح الشبيهة بالصرع لحرمان تدريجي وخاضع للرقابة من المصل في الوسط. من 9 أيام في المختبر (DIV) فصاعدا ، يتم الاحتفاظ بالشرائح في الدوري الاميركي للمحترفين بدون HS.
< p class = "jove_title" >2. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية
ملاحظة: تم إجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في شرائح النمط العضوي لقشرة الأنف والحصين في 7 و 14 و 21 DIV في غرفة من نوع الواجهة. تم الحصول على التسجيلات باستخدام مكبر للصوت ورقمنتها وتحليلها باستخدام البرنامج. تم ترشيح جميع التسجيلات بتمرير النطاق (مرشح بيسل ذو ثمانية أقطاب عند 60 هرتز ومرشح غاوسي عند 600 هرتز).
- التحضير للإعداد
- تحضير 50 مل من وسط NBA مع 1 مل من B27 و 250 ميكرولتر من L-Glutamine. قم بالإحماء عند 37 درجة مئوية.
- اضبط إعداد الفيزيولوجيا الكهربية في دائرة مغلقة. تحقق مما إذا كان معدل التدفق 2 مل / دقيقة.
- افتح صمام صندوق السيارة (5٪ CO2/95٪ O2) وتحقق من مستوى الماء في النظام.
- ضع ورق الترشيح في حجرة تسجيل الواجهة لتصريف الوسط الزائد وورق تنظيف العدسة أسفل الإطار لتزويد الشريحة بوسيط.
- قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة ومكبرات الصوت وأداة المعالجة الدقيقة.
- دع درجة الحرارة في غرفة الواجهة تستقر عند 37 درجة مئوية قبل بدء التسجيلات.
- تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF: 124 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي كلوريد كلوريد ، 1.2 ملي هيدروجينهيدروجيني 2PO4 ، 25 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، 10 ملي جلوكوز ، 2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1 ملي ملي مجمسلزو 4 مع درجة الحموضة 7.4) واستخدمه لملء القطب الزجاجي بحقنة. ضعه في قطب الاستقبال.
- تسجيلات النشاط التلقائي
- بمجرد أن تصبح درجة الحرارة مستقرة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وقطع شريحة واحدة من الملحق بشفرة حادة للغاية. ضعه في طبق 60 مم مع قطرة متوسطة. اصطحبه إلى غرفة تسجيل الواجهة.
- ضع الشريحة في حجرة الواجهة مع الحصين في أسفل اليمين. ضع القطب المستقبل في طبقة الخلية الهرمية CA3.
- انتقل إلى بروتوكول الاستحواذ المستمر وسجل لمدة 30 دقيقة.
